任 橋，徐 玉，劉煥奇，張啟迪，畢可東

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島266109）

氟苯尼考是由美國先靈－葆雅公司于20世紀(jì)80年代末研制成功的一種新型動物專用酰胺醇類廣譜抗菌藥，具有抗菌廣譜、吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效等特點，對敏感菌所致的畜禽細菌性疾病治療效果顯著［1］。該藥對敏感菌的抗菌活性與氯霉素和甲砜霉素相似，但對耐氯霉素及甲砜霉素的細菌仍然表現(xiàn)出較高的抗菌活性，如大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌及傷寒沙門菌等［2－4］。

氟尼辛葡甲胺是美國先靈－葆雅公司于20世紀(jì)90年代研發(fā)的已經(jīng)批準(zhǔn)的少數(shù)獸用非甾體類藥物之一，其解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用強，不良反應(yīng)輕微，劑型和給藥方式多樣，靶動物和臨床適應(yīng)癥廣，為國外獸醫(yī)臨床消費量最大的非甾體類抗炎藥［5－8］。

細菌感染性疾病不僅嚴(yán)重威脅動物的健康，而且還影響動物的生產(chǎn)性能。目前對畜禽的細菌性感染的治療主要是采用抗生素療法，依靠抗生素的抑菌殺菌作用，迅速清除體內(nèi)病原菌。在獸醫(yī)臨床工作中，常注重應(yīng)用抗生素的抑菌殺菌作用，而忽略對細菌感染性疾病的對癥治療。本試驗以氟苯尼考和氟尼辛葡甲胺為主藥，既利用氟苯尼考對動物體內(nèi)的病原微生物的抑制作用進行對因治療，又利用氟尼辛葡甲胺的解熱、鎮(zhèn)痛，抑制炎性因子等作用進行對癥治療，研制氟苯尼考復(fù)方制劑，為氟苯尼考新制劑的研發(fā)和方便臨床用藥、提高療效提供藥劑學(xué)理論根據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 氟苯尼考（含量99．3%，批號：100912），氟尼辛葡甲胺（含量99．4%，批號：1211－00409，齊魯晟華制藥有限公司），溶劑，購自天津市巴斯夫化工有限公司；N，N－2－甲基－乙酰胺，穩(wěn)定劑，苯甲醇，乙醇胺等均為分析純，購自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。無水亞硫酸鈉為市售商品。

1．2 儀器 AR2140電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）；HHSYⅡ電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器設(shè)備廠）；DHG－9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密試驗設(shè)備有限公司）；YB－Ⅲ型澄明度檢測儀（廈門中村光學(xué)儀器廠）；ZDX－35BI型坐式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；TH2－C型恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠）；85－2控溫磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）。

1．3 復(fù)方氟苯尼考注射液的處方篩選及優(yōu)化 采用單因素分析方法，并結(jié)合氟苯尼考和氟尼辛葡甲胺理化性質(zhì)選取符合要求的溶劑、助溶劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和pH值調(diào)節(jié)劑。經(jīng)過多次預(yù)試驗，確定影響復(fù)方制劑穩(wěn)定性的主要因素為輔料的種類及用量等。然后選擇多種輔料進行正交試驗，以藥物含量作為處方篩選標(biāo)準(zhǔn)，以溶劑一、穩(wěn)定劑、滅菌用水與溶劑一的比例、二甲基乙酰胺作為考察因素，采用L9（33）正交設(shè)計優(yōu)選處方，正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交因素水平考察

1．4 處方工藝 將氟尼辛葡甲胺加到一定量的滅菌用水中加熱攪拌至澄清，然后加入無水亞硫酸鈉，并加熱到45℃攪拌至澄清，得溶液a；將氟苯尼考溶解在一定量的溶劑一中，用攪拌器勻速攪拌，使之完全溶解，然后加入二甲基乙酰胺、穩(wěn)定劑，繼續(xù)用攪拌器攪拌至澄清，得溶液b；合并上述的溶液a和溶液b，加熱攪拌至澄清，再加入局部止痛劑苯甲醇，攪拌混合均勻后，用乙醇胺調(diào)節(jié)pH值6．5～7．5后，用微孔濾膜過濾，裝瓶。

1．5 質(zhì)量控制

1．5．1 澄明度檢查 參照《中國獸藥典》2010版第一部可見異物檢測法進行澄明度檢查［9］。取復(fù)方氟苯尼考注射液轉(zhuǎn)移至潔凈透明的專用玻璃容器內(nèi)，用YB－Ⅲ型澄明度檢測儀分別在黑色和白色背景下，用手持玻璃容器頸部使藥液輕輕翻轉(zhuǎn)，距20cm處觀察。藥液中凡有塊狀、點狀物、玻璃屑、脫片等塊狀物、混濁和沉淀的，均作廢品處理，不合格。

1．5．2 pH值檢查 用精密pH計測定。

1．5．3 無菌檢查 取復(fù)方氟苯尼考注射液6瓶，每批2瓶，采用直接接種法將藥液接種在普通營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)48h后再接種至普通營養(yǎng)平板，37℃培養(yǎng)48～72h。取0．9%無菌氯化鈉溶液同法操作，作為陰性對照；取0．9%有菌氯化鈉溶液同法操作，作為陽性對照。若營養(yǎng)肉湯清亮透明，營養(yǎng)瓊脂平板無菌生長，則表明制劑無菌，符合規(guī)定；若普通肉湯混濁或營養(yǎng)瓊脂平板有菌落繁殖（涂片鏡檢），則不符合規(guī)定。

1．5．4 熱原檢查 根據(jù)2010版中國獸藥典，采用家兔熱原檢測法［10］。取3批復(fù)方氟苯尼考注射液，取健康家兔3只，測定其正常體溫后15min以內(nèi)，按20mg／kg體重劑量，肌肉注射復(fù)方氟苯尼考注射液，然后每隔1h按前法測量體溫1次，共6次。以6次體溫中最高的1次減去正常體溫，即為該家兔體溫的升高度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高0．6℃或0．6℃以上，或3只家兔體溫升高均低于0．6℃，但升高的總數(shù)達1．4℃或1．4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復(fù)試，方法同上。在規(guī)定的時間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定該供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。

2 結(jié)果

2．1 復(fù)方氟苯尼考注射液的處方篩選 按L9（33）正交表安排試驗，由表2試驗數(shù)據(jù)及極差R的大小可以判斷出影響復(fù)方注射液穩(wěn)定性的因素主次順序為：溶劑一 ＞穩(wěn)定劑＞滅菌用水與溶劑一的比值＞二甲基乙酰胺，并可得出最佳處方為A2B2C3D1的組合，即溶劑一（25%），穩(wěn)定劑（10%），滅菌用水與溶劑一的比值（3∶2），二甲基乙酰胺（15%）。最優(yōu)處方為氟苯尼考10%～30%，氟尼辛葡甲胺0．5%～2．5%，注射溶劑45%～65%，穩(wěn)定劑10%，抗氧化劑0．1%～0．2%，滅菌用水加至100mL。

2．2 復(fù)方氟苯尼考注射液的質(zhì)量控制

2．2．1 澄明度檢查結(jié)果 結(jié)果表明，注射液為淡黃色澄清液體，均未檢出可見異物，可以判定復(fù)方氟苯尼考注射液制劑澄明度符合藥典規(guī)定。

2．2．2 pH值檢查結(jié)果 注射液的pH值（要求與血液相等或接近），一般控制在4．0～9．0的范圍內(nèi)，經(jīng)測定所配制的注射液的pH值都在6．5～7．5之間，符合注射液pH值要求。

2．2．3 無菌檢查結(jié)果 將接種的營養(yǎng)肉湯48h后自培養(yǎng)箱中取出觀察結(jié)果：注射液和陰性對照肉湯透明；陽性對照渾濁。再將肉湯和注射液分別接種至營養(yǎng)瓊脂平板，恒溫培養(yǎng)2d后取出觀察：僅陽性對照有白色菌落。表明該制劑符合藥典規(guī)定的無菌要求。

2．2．4 熱原檢查結(jié)果 熱原檢查家兔體溫變化情況見表3。

表2 正交試驗

表3 熱原檢查家兔體溫變化情況

由表3可以看出，3只家兔體溫升高分別為0．13℃、0．07℃、0．20℃，均低于0．6℃，升高總數(shù)為0．40℃，低于1．4℃，由此可以判定復(fù)方氟苯尼考注射液制劑中所含熱原的限度符合藥典規(guī)定。

3 討論

本試驗采用單因素結(jié)合正交試驗的方法，成功制備了氟苯尼考的復(fù)方注射劑，且該制劑制備工藝簡單，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

正交試驗表明，溶劑是影響注射液的主要因素，注射劑溶劑起溶解、混懸或乳化藥物的作用，因此，必須符合注射用的要求。氟尼辛葡甲胺易溶于水，而氟苯尼考在水中幾乎不溶，故選擇溶劑時，應(yīng)考慮二者的物理性質(zhì)，選出合適的溶劑。通過多次預(yù)試驗，表明溶劑一對注射劑穩(wěn)定性的影響較大，可能由于氟苯尼考比較難溶，若溶解不徹底，短時間常溫放置即可析出。通過加入助溶劑以增加其在某一特定溶劑中的溶解度，以達到臨床治療所需濃度要求，并能保持注射液的穩(wěn)定性。通過試驗表明，N－N－二甲基甲酰胺按一定比例加入，可以達到較好的溶解效果，但是經(jīng)二甲基乙酰胺助溶后的氟苯尼考溶液，與水混合后很不穩(wěn)定，需選擇合適的穩(wěn)定劑，增加注射液的穩(wěn)定性，這與相關(guān)報道［11］相一致。

參照注射液的質(zhì)量要求對復(fù)方氟苯尼考注射液分別進行澄明度檢查、酸堿度檢查、無菌檢查和熱原檢查。結(jié)果顯示，復(fù)方氟苯尼考注射液澄明度檢查未檢出可見異物，注射液pH值在6．5～7．5之間，無熱原，無菌檢查符合要求。

［1］ Nordmo R，Varma K J，Sutherland I H．Florfenicol in Atlantic Salmon，SalmosalarField Evaluation of Efficacy against Frurnculo－sis in Norway［J］．JournalofFishDiseases，1994（17）：239－244．

［2］ 周洪波．氟苯尼考和中藥黃芪淫羊藿合劑對雞體免疫反應(yīng)的影響［D］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003．

［3］ 董永軍．新型獸用廣譜抗菌素氟苯尼考研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（15）：3693－3694．

［4］ Stein J．Chemically defined structured lipids：current status and future directions in gastrointestinal diseases［J］．Int J Colorectal Dis，1999，14（2）：79－85．

［5］ Odensvik K，Cort N，Basu S，etal．Effect of flunixin meglumineon prostaglandin F2alpha synthesis and metabolism in the pig［J］．Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1989，12（3）：307－311．

［6］ Odensvik K，Magnusson U．Effect of oral administration of flunixin meglumine on the inflammatory response to endotoxin in heifers［J］．American Journal of Veterinary Research ，1996，57（2）：201－204．

［7］ 陳杖榴．獸醫(yī)藥理學(xué)［M］．3版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：186．

［8］ Adams H R．Veterinary Pharmacology and Therapeutics［M］．8th ed．Ames：Iowa State University Press，2000：442－443．

［9］ 中國獸藥委員會．中華人民共和國獸藥典第一部［M］．2010年版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：95．

［10］中國獸藥委員會．中華人民共和國獸藥典第一部［M］．2010年版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：129－130．

［11］劉照云．氟苯尼考溶液研制及其穩(wěn)定性試驗和臨床療效研究［D］．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．