李麗華，喻麗珍，趙志剛，王國棟

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241002）

真菌多糖是自然界中存在種類較多、生物活性較高的一類活性多糖，是當今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點[1].此類多糖具有很強的生物活性，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗衰老、抗氧化等方面，在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[2]”.

擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）是從玉米秸稈中分離的一株木霉，屬于真菌類半知菌亞門、絲胞綱、木霉屬.擬康氏木霉胞外多糖（Extracellular polysaccharides of trichoderma pseudokoningii,TPeps）是采用液體發(fā)酵法，從擬康氏木霉中得到一類結(jié)構(gòu)新穎的多糖.魏廣金[3]從該多糖中分離得到兩個組分TPeps-1和TPeps-2，并和郭敏等通過實驗證明，這兩個組分可提高番茄和黃瓜葉片水楊酸含量，激活植物的活性氧爆發(fā)使之產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性及系統(tǒng)抗性，起到預(yù)先免疫的作用[4-6].孔夢麗[7]發(fā)現(xiàn)TPeps-1能增強小鼠的免疫功能，黃濤濤[8]的研究則表明[7]TPeps-1體外能顯著促進巨噬細胞的吞噬活性，抑制白血病細胞K562的增殖.

上述文獻說明擬康氏木霉胞外多糖的兩個單一組分特別是TPeps-1體內(nèi)外具有多種生物學(xué)活性，但有關(guān)該總多糖實驗或報道則甚少或空缺，為了探索擬康氏木霉胞外總多糖是否具有良好的免疫活性，我們開展了本文中的實驗研究.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬康氏木霉胞外總多糖（TPeps）：實驗室自制；注射用環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；綿羊紅細胞：蕪湖市衛(wèi)生防疫站.

1.2 實驗動物

昆明種小鼠180只，雌雄各半，(20±2)g，購于南京江寧青龍山動物繁殖場.

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

昆明種小鼠，按體重隨機分成隨機分成4組：模型組、TPeps低、中、高劑量組，每組12只.同時另取12只作正常對照組，其中模型組和正常對照組按20ml/kg體重的容積灌胃生理鹽水，三個給藥組分別按 50、100、200mg/(kg·d)劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7天.

1.3.2 免疫低下動物模型的建立

除空白對照組外，上述各組小鼠均于第1、2、3天腹腔注射新配制的環(huán)磷酰胺70mg/kg，造成免疫低下動物模型.

1.3.3 對非特異性免疫功能的影響—碳粒廓清法[10]

上述五組小鼠末次給藥后，立即給予20%的印度墨汁0.1m l/10g尾靜脈注射，并分別于第2分鐘及第10分鐘后進行眼眶取血20μl，將所取眼眶血加入到盛有2ml的0.1%碳酸鈉溶液試管中，于680nm處測其吸光度值.將小鼠處死，取其肝臟、脾臟并稱重，根據(jù)以下公式計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù).

臟器指數(shù)＝臟器重量（mg）/小鼠體重（g）

1.3.4 對體液免疫功能的影響—血清溶血素法[11]

給予五組小鼠每日腹腔注射0.2ml的20%綿羊紅細胞致敏.末次給藥后1小時，對小鼠進行眼球取血，并分離血清.將50μl血清以生理鹽水稀釋500倍.取稀釋后的血清1m l、5%的綿陽紅細胞0.5m l及10%的豚鼠血清1m l放入試管混勻，置于37℃水浴保溫10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至冰浴中終止反應(yīng).以3000轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液1ml加入都氏試劑3m l，混勻后室溫放置10分鐘，于540nm處測定吸收值.另外取試驗用的經(jīng)過洗滌的5%綿羊紅細胞0.25ml，加3.75m l都氏試劑，混勻后室溫放置10分鐘，540nm處比色，所得值即為綿羊紅細胞半數(shù)溶血時的吸收度值.

樣品的半數(shù)溶血值（HC50）=（樣品的吸收度值/綿羊紅細胞半數(shù)溶血時吸收度值）×500

1.3.5 對細胞免疫功能的影響—DTH法[11]

各組小鼠給藥第3日同時致敏.腹部脫毛，在脫毛處涂于1%二硝基氟苯（DNFB）25μl，次日強化，致敏第4日右耳涂以DNFB 10μl進行攻擊.24小時后將小鼠處死，用打孔器取下左右耳片，稱重，以左右耳片之差表示DTH強度.

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS軟件分析，采用平均值±標準差表示，組間差異采用T檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 對非特異性免疫功能的影響

實驗結(jié)果顯示，腹腔注射70mg/kg環(huán)磷酰胺能顯著抑制小鼠的免疫功能，而TPeps50、100mg/kg劑量組能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)，其中100mg/kg劑量組還能提高脾指數(shù)，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明TPeps具有增強非特異性免疫功能的作用.見表1.

表1 TPeps對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（)

表1 TPeps對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響（)

與正常組比較 aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較 cP＜0.01(以下同)

組別 動物數(shù)/n 劑量/（mg/kg·d） 胸腺指數(shù)/mg·g 脾指數(shù)/mg·g正常組 12 4.15±0.49 11.04±1.03模型組 10 1.34±0.54c 6.71±1.32c TPeps低劑量組 12 50 1.82±0.51a 7.15±1.28 TPeps中劑量組 11 100 1.91±0.39b 7.91±1.34a TPeps高劑量組 10 200 1.45±0.48 6.56±1.12

2.2 對體液免疫功能的影響

TPeps低、中劑量組可使免疫低下的小鼠溶血素水平呈顯著回升趨勢，與模型組比較差異顯著（P<0.01），表明該多糖對體液免疫功能有增強作用.見表2.

表2 TPeps對免疫低下小鼠血清溶血素含量的影響()

表2 TPeps對免疫低下小鼠血清溶血素含量的影響()

/n 劑量/血清溶血素組別 動物數(shù)（mg/kg·d）/HC50正常組 12 511.3±50.9模型組 10 309.9±77.5c TPeps低劑量組 11 50 372.9±37.6a TPeps中劑量組 12 100 397.3±46.2b TPeps高劑量組 11 200 369.6±71.7

2.3 對細胞免疫功能的影響

結(jié)果顯示，TPeps低、中劑量組可使免疫抑制的小鼠DTH反應(yīng)升高，與模型組比較具有明顯差異（P<0.05），表明該多糖具有增強細胞免疫功能的作用.見表3.

3 討論

本文實驗結(jié)果顯示，擬康氏木霉胞外總多糖50～200μg/mL濃度能夠有效刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖，但低濃度刺激并不明顯.此外，動物實驗顯示該多糖低、中、高三個劑量組，其中50mg/kg和100mg/kg劑量組增強免疫功能的作用較強，而200mg/kg劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是因為隨著劑量的加大，多糖的溶解度降低所致.

表3 TPeps對免疫低下小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)的影響(，n=10)

表3 TPeps對免疫低下小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)的影響(，n=10)

/（mg/kg·d） 耳殼重量/mg DTH組別 劑量 右 左 強度正常組 13.9±1.55 10.6±0.74 3.3±1.86模型組 11.7±1.53 10.5±1.17 1.14±1.24c TPeps 低劑量組 50 12.8±0.91 10.7±0.67 2.13±0.84a TPeps 中劑量組 100 12.4±0.69 10.1±0.57 2.26±0.89a TPeps 高劑量組 200 11.9±1.09 10.1±1.08 1.75±1.14

通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，擬康氏木霉胞外總多糖也有較好的增強免疫的功能，它在免疫方面的突出表現(xiàn)，也預(yù)示著其可能具有一定的抗腫瘤作用.此外，我們的前期實驗也表明該多糖體外確實具有一定的抗癌活性.但有關(guān)該總多糖免疫活性的系統(tǒng)研究及與其單一組分的免疫活性比較，免疫活性和抗腫瘤作用之間的關(guān)系尚需進一步探索.

〔1〕歐陽天贄，李小定，榮建華.真菌多糖抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006（18）：524-528.

〔2〕李慧玲，程玉鵬，蔣倩倩，等.藥用真菌多糖抗腫瘤研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥，2011，24（1）：118-121.

〔3〕魏廣金.擬康氏木霉胞外多糖的分離純化及其生物活性研究[D].濟南：山東大學(xué)，2010.

〔4〕魏廣金，相海英，陳靠山.擬康氏木霉胞外多糖的分離純化及其對黃瓜幼苗活性氧的誘導(dǎo)[J].臨沂師范學(xué)院學(xué)報，2009，1（3）:101-104.

〔5〕郭敏，柳春燕，陳靠山.擬康氏木霉胞壁多糖對黃瓜抗病性的誘導(dǎo)作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21(5)：748-751.

〔6〕郭敏，石磊，陳靠山.擬康氏木霉胞外多糖對番茄灰霉病的誘抗作用及對幾種防御酶活性的影響[J].曲阜師范大學(xué)學(xué)報，2005，31（2）：99-102.

〔7〕孔夢麗.擬康氏木霉胞外多糖對小鼠的免疫增強活性研究[D].濟南：山東大學(xué)，2011.

〔8〕Huang TT,Lin J,Cao JF,Zhang PY,et al.An exopolysaccharide from Trichodermap seudokoningii and its apoptotic activity on human leukemia K562 cells[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(2):701–708.

〔9〕郝林華，牛德慶，陳靠山，等.擬康氏木霉液態(tài)發(fā)酵條件的研究[J].菌物學(xué)報，2005，24(2)：235-244.

〔10〕徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)（第二版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.676，1226-1228.

〔11〕張驃，孔群，許惠琴，等.靜安口服液治療小兒多發(fā)性抽動癥的藥效研究[J].中國藥師，2008，11(8):878-881.