王 征 魁, 曹 體 爽, 劉 廷 強(qiáng), 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院`, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

白頭翁皂苷主要分為羽扇豆烷型與齊墩果烷型兩類數(shù)十種皂苷及皂苷元[1]。研究者們發(fā)現(xiàn)皂苷有許多生理活性,如人參皂苷Rb1抗心腦血管系統(tǒng)疾病作用[2],白頭翁皂苷的增強(qiáng)免疫、保肝抗炎、抗癌作用等[3]。

許多研究結(jié)果表明,天然苷類的分子結(jié)構(gòu)并不是最佳活性狀態(tài),若有目的地水解掉皂苷上的糖基,使其轉(zhuǎn)化為高活性次生皂苷,將會(huì)極大地提高其生理活性和應(yīng)用價(jià)值[4]。楊宇等[5]成功地純化了白頭翁皂苷糖苷酶并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)首先從藥材白頭翁中提取出白頭翁總皂苷作為底物,并對(duì)其進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化,將得到的產(chǎn)物和底物用硅膠柱層析法進(jìn)行分離純化,得到了較純的底物和產(chǎn)物的純品。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

白頭翁,產(chǎn)地湖北；菌種Absidiasp.P00r,由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所提供;硅膠,青島海洋化工廠；薄層層析板(TLC),德國(guó)Merck公司；色譜儀,Waters2695高效液相色譜分析儀；TLC展開劑V(氯仿)∶V(甲醇) ∶V(水)=7∶3∶0.5。

1.2 方 法

1.2.1 硅膠柱分離純化白頭翁總皂苷

首先使用醇提法提取中藥白頭翁所含的總皂苷,再用硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離純化。

稱取一定量的白頭翁總皂苷,用適量甲醇溶解于3倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠,加熱攪拌均勻至溶劑揮干。稱取15倍樣品質(zhì)量300～400目硅膠,均勻倒入底部鋪好脫脂棉的硅膠柱,再鋪層80～100目緩沖膠,然后倒入樣品膠。

皂苷的分離純化:用一定量的純氯仿通柱,按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8.3∶1.7依次進(jìn)行洗脫。

1.2.2 酶轉(zhuǎn)化白頭翁總皂苷

按照m(麥麩)∶m(白頭翁)=4∶1配制一定量固體培養(yǎng)基,在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min,無菌室紫外線滅菌30 min。將菌種接入培養(yǎng)基,30 ℃條件下培養(yǎng)7 d,其間定時(shí)翻動(dòng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后,培養(yǎng)基與緩沖液按體積比1∶5加入pH 5.0、0.02 mol/L 的NaAc-HAc緩沖液,浸泡2 h。分別經(jīng)過紗布過濾、離心(均保留液相),加入3倍體積的95%乙醇,離心保留沉淀。沉淀用與培養(yǎng)基等體積的緩沖液溶解,即得酶液。

配制1 L 2%的底物溶液,與等量酶液混合后加入反應(yīng)釜，40 ℃下反應(yīng)90 h,95%乙醇溶液終止反應(yīng),上清液濃縮蒸干乙醇后加適量水溶解,用正丁醇將酶解產(chǎn)物萃取出來,蒸干待用。

1.2.3 硅膠柱分離純化產(chǎn)物皂苷

用一定量的純氯仿通柱,依次按V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5的洗脫比例進(jìn)行洗脫,分別收集洗脫液。

1.2.4 HPLC法檢測(cè)純化后的底物和產(chǎn)物

色譜柱:Kromasil C18柱(5 μm,Φ4.6 mm×200 mm)。色譜條件:進(jìn)樣量，10 μL；柱溫,35 ℃；體積流量,1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng),205 nm。流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B),進(jìn)行梯度洗脫:0～10 min,φA=28%；10～15 min,φA=28%～32%；15～30 min,φA=32%～40%；30～45 min,φA=40%～100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠柱分離純化白頭翁總皂苷

白頭翁經(jīng)70%酒精浸泡、濃縮浸提液,再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂脫糖、D-296樹脂脫色后,蒸干洗脫液即得白頭翁總皂苷,分離純化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,使用硅膠柱進(jìn)行不同比例梯度洗脫,分離底物皂苷效果較好,組分A與組分B在V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5下依次洗脫出來；組分C與組分D則在V(氯仿)∶V(甲醇)=8.3∶1.7下洗脫出來,其得率分別達(dá)到了10.6%、13.8%、8.2%、15.3%。

圖1 硅膠柱分離底物皂苷TLC圖

Fig.1 Saponins substrate separated by silica gel column on TLC

2.2 硅膠柱分離純化產(chǎn)物皂苷

稱取反應(yīng)后皂苷10 g,同樣按照方法“1.2.1”制備硅膠柱,再依次按V(氯仿) ∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5進(jìn)行洗脫,未反應(yīng)組分未收集，洗脫結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,使用硅膠柱進(jìn)行不同比例梯度洗脫,分離產(chǎn)物皂苷效果較好,在V(氯仿) ∶V(甲醇)=8.5∶1.5時(shí),產(chǎn)物a、b、c均能被洗脫出來,得率分別達(dá)到了15.0%、7.1%、10.3%。

圖2 硅膠柱分離產(chǎn)物皂苷TLC

Fig.2 Enzymatic products separated by silica gel column on TLC

2.3 HPLC檢測(cè)底物及產(chǎn)物單品

稱取少量底物、產(chǎn)物分離后的各組分,用甲醇溶解配制成1 mg/mL溶液,進(jìn)行HPLC檢測(cè),結(jié)果如圖3、4所示。由圖3、4可知,底物純度分別為83.94%、81.99%、80.18%、83.40%，產(chǎn)物純度分別為93.45%、91.28%、100.00%。

(a) 底物A

(b) 底物B

(a) 產(chǎn)物A

3 結(jié) 論

菌種Absidiasp.P00r經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)酶能良好地催化白頭翁底物生成產(chǎn)物；使用硅膠柱層析法,洗脫梯度為V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8.3∶1.7，分離底物皂苷效果較好,得率分別為10.6%、13.8%、8.2%、15.3%,經(jīng)過HPLC檢驗(yàn)純度分別為83.94%、81.99%、80.18%、83.40%；洗脫梯度為V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5，分離產(chǎn)物皂苷效果較好,得率分別為15.0%、7.10%、10.3%,經(jīng)過HPLC檢驗(yàn)純度分別為93.45%、91.28%、100.00%，底物與產(chǎn)物均達(dá)到分離純化的效果。

[1] 時(shí)維靜,李立順,董衛(wèi)星. 白頭翁化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2009(4):22-25.

[2] 賈繼明,王宗權(quán),吳立軍,等. 人參皂苷Rb1的藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2008, 33(12):1371-1377.

[3] 路西明,王學(xué)廷,王建剛. 白頭翁對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1998, 15(2):32-34.

[4] 劉琳,金鳳燮. 白頭翁皂苷的分離提純[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 23(1):18-21.

(LIU Lin, JIN Feng-xie. Separation and purification of pulsatilla saponin[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2004, 23(1):18-21.)

[5] 楊宇,王東明,金鳳燮,等. 白頭翁皂苷糖苷酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(6):404-407.

(YANG Yu, WANG Dong-ming, JIN Feng-xie, et al. Purification of pulchinenoside-glycosidase and its enzymatic characteristics[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2009, 28(6):404-407.)