房春燕 蒲旭輝 孫文啟 許莉莉 韓慧蓉 王 輝 康 白

(濰坊醫(yī)學院應(yīng)用藥理學實驗室，山東 濰坊 261053)

中醫(yī)藥在心衰防治領(lǐng)域取得了很大進展。絲瓜絡(luò)(RLF)是葫蘆科植物絲瓜的干燥成熟果實維管束。本室近期工作證明:RLF對慢性心力衰竭(CHF)大鼠的血流動力學具有明顯改善作用〔1〕。但國內(nèi)外尚無RLF影響心功能的機制報道，本研究通過復(fù)制心衰模型，采用RT-PCR技術(shù)，系統(tǒng)觀察RLF對心衰大鼠心臟鈣調(diào)蛋白(CaM)基因表達的影響，以明確心衰時CaM的變化，從基因水平、鈣調(diào)節(jié)的角度初步探討RLF干預(yù)CHF，是否與調(diào)節(jié)CaM mRNA水平有關(guān)，為抗心衰中藥的研發(fā)和開發(fā)研究RLF的藥理作用及新的臨床用途提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 戊巴比妥鈉，為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，批號20041117;異丙腎上腺素，購自上海禾豐藥業(yè)有限公司，批號080702;絲瓜絡(luò)水煎劑(自制);RNA提取試劑盒Rneasy MiniKit，德國QIAGEN公司;TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國PE公司;SYBRTM Green PCR Core Reagents試劑盒，美國PE公司;PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成;5700型定量基因分析儀，美國PE公司;瓊脂糖，加拿大BBI公司;GENE GENIUS數(shù)碼凝膠成像儀，英國SYNGENE公司。

1.2 動物 健康成年Wista大鼠40只，體質(zhì)量(220±20)g，雌、雄各半，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2008 0002。隨機分為對照組，模型組，RLF小劑量組和RLF大劑量組。自由飲食飲水，自然光照，單籠飼養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模、給藥及取材 除對照組外，其余各組參照蒲旭輝等〔1，2〕改良的異丙腎上腺素皮下注射法制備CHF模型。具體操作為大鼠皮下多點注射異丙腎上腺素，第1天20 mg/kg，第2天 10 mg/kg，第 3 天 5 mg/kg，然后以 3 mg·kg-1·d-1劑量連續(xù)用藥9 d。用藥期間觀察大鼠毛色、食欲、活動情況等心衰癥狀。RLF小、大劑量組分別給予RLF水煎劑5、10 g·kg-1·d-1，對照組和模型組則給予等量生理鹽水，灌胃給藥，連續(xù)用藥28 d。于末次灌胃后，禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔，迅速取其心尖部組織約50 mg，放入凍存管，并立即置于液氮中固定，然后轉(zhuǎn)入低溫冰箱-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT-PCR檢測心臟CaM mRNA的表達 從GenBank中查出大鼠CaM和β-actin的mRNA序列，并參考相關(guān)文獻，利用美國PE公司引物設(shè)計軟件Primer Express設(shè)計專一性引物，見表1，并由上海生工生物工程公司合成。將凍存的各組大鼠心尖部組織標本稱重，每個取約20 mg，按照RNA提取試劑盒Rneasy MiniKit(QIAGEN，Germany)說明書提取總 RNA。取5 μg總 RNA，按照 TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PE，USA)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用oligo d(T)為引物，加入50 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，于25℃孵育10 min，37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min，70℃逆轉(zhuǎn)錄滅活10 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μl，150 nmol/L上下游引物，加入25 μl反應(yīng)體系中，用SYBR?Green PCR Core Reagents試劑盒(PE，USA)擴增cDNA樣品。首先50℃孵育2 min，95℃激活酶 10 min，然后以 95℃ 變性15 s，61℃ 退火 30 s，72℃ 延伸10 min，循環(huán) 40 次(GeneAmp 5700?，Perkin Elmer)。取 RTPCR產(chǎn)物10 μl，于2%瓊脂糖凝膠，5 V/cm恒壓電泳50 min，用Gene genius Bio-imaging system數(shù)碼成像分析系統(tǒng)對瓊脂糖凝膠進行觀察并拍照。根據(jù)各組大鼠心臟CaM mRNA表達產(chǎn)物的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照，計算每一樣品對應(yīng)其內(nèi)參的相對含量。為了避免實驗操作過程中的誤差，以及所取心臟組織重量不同所帶來的誤差，以大鼠CaM與β-actin DNA擴增產(chǎn)物量Ct值的比值，即Ct CaM/Ct β-actin，來衡量RLF對大鼠心肌CaM mRNA表達水平的影響，該比值越低，表明組織中CaM mRNA的表達越強烈。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 結(jié)果

圖1 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1 特異性擴增產(chǎn)物 通過瓊脂糖凝膠電泳核實擴增產(chǎn)物長度，并檢驗有無特異性擴增。心臟CaM mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖像證明，對照組、模型組、RLF各組在115 bp和134 bp處各可見一清晰的電泳條帶，與預(yù)期的CaM mRNA(115 bp)和βactin mRNA(134 bp)基因片段長度一致，證明所擴增片段為特異性擴增，見圖1。

2.2 心肌CaM mRNA的表達 與對照組相比，模型組大鼠心臟Ct CaM/Ct β-actin明顯降低(P＜0.05)，說明模型組大鼠心肌細胞CaM mRNA的表達顯著高于對照組。與模型組相比，RLF大劑量組大鼠心臟 Ct CaM/Ct β-actin明顯升高(P＜0.05)，說明RLF可使CaM mRNA的表達顯著下調(diào)。而RLF小劑量組對大鼠心肌CaM mRNA表達水平的影響無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

表2 RLF對心衰大鼠心肌CaM mRNA表達的影響(± s，n=8)

表2 RLF對心衰大鼠心肌CaM mRNA表達的影響(± s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 Ct CaM Ct β-actin Ct CaM/Ct β 18.545±0.921 15.973±0.626 1.158±0.033模型組 14.595±0.369 14.422±0.623 1.017±0.0191)絲瓜絡(luò)小劑量組 14.358±0.528 14.432±0.529 1.000±0.019絲瓜絡(luò)大劑量組 16.403±0.517 14.758±0.379 1.113±0.0282)-actin對照組

3 討論

隨著對心衰病理生理學的深入研究，心衰時心肌細胞的Ca2+傳遞功能是否發(fā)生改變，從而影響心肌功能，已被廣泛關(guān)注。心肌細胞Ca2+循環(huán)異常在心衰的發(fā)病中占有重要地位〔3〕，心衰時心肌細胞內(nèi)存在鈣超載狀態(tài)〔4〕。Ca2+是一種重要的參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使，是興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵物質(zhì)。心衰發(fā)生時，衰竭心肌的鈣穩(wěn)態(tài)遭到破壞，進而影響心肌的收縮和舒張功能。很多藥物通過影響細胞內(nèi)Ca2+而發(fā)揮其藥理效應(yīng)，故細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控及其作用機制近年來受到極大重視。CaM是一種廣泛分布于細胞內(nèi)的鈣結(jié)合蛋白，通過ApoCaM和Ca2+/CaM兩種形式影響細胞內(nèi)鈣調(diào)控系統(tǒng)〔5，6〕，參與心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)和鈣穩(wěn)態(tài)的維持〔7，8〕。目前認為CaM表達的變化與心衰發(fā)生時心功能的異常密切相關(guān)〔9～11〕。

近年來，隨著臨床、實驗研究的不斷深入，中醫(yī)藥治療心衰，在改善癥狀、提高生存質(zhì)量、多靶點治療、減少不良反應(yīng)等方面顯示了其特色與優(yōu)勢。因此對抗心衰中藥的研究有著非常重要的理論意義和臨床價值。RLF具有通經(jīng)活絡(luò)、祛風活血，化痰行氣等功效。黎炎等〔12〕的研究結(jié)果表明，RLF中含有多種化學成分，其中包含苷類(皂苷、強心苷)。甙類對心血管的作用主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)血脂和影響心功能兩個方面。李菁等〔13〕研究顯示，RLF可抑制體重增長和降低血脂水平;關(guān)穎等〔14〕研究表明，RLF可減輕心肌缺血-再灌注損傷。據(jù)此推測，RLF具有保護心肌細胞的功能，而本室先前的研究結(jié)果也表明〔1〕，RLF大劑量長期應(yīng)用，可明顯升高 CHF大鼠 LVSP、+dp/dtm，降低HR、LVEDP和CI，顯著改善CHF大鼠的心臟功能。但RLF影響心功能的具體機制，尚未見報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)RLF對CHF的治療作用具有劑量依賴性，只有大劑量給藥才能起到干預(yù)CHF的效果。另外，RLF大劑量組大鼠心肌CaM mRNA的表達下降，意味著心肌CaM的含量相對減少，而CaM的減少可以使Ca2+/CaM結(jié)合減少，通過減少對蛋白激酶C的活化，進而抑制Na+-Ca2+交換，減少Ca2+內(nèi)流，減輕心肌細胞內(nèi)鈣超載，在一定程度上恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)，從而改善心衰大鼠的心功能。

綜上所述，RLF可以改善心功能，干預(yù)心衰，該保護作用可能與抑制心肌細胞內(nèi)CaM mRNA的表達有關(guān)。由此推測RLF可能對CHF有一定的防治作用，而這一研究結(jié)果為發(fā)現(xiàn)RLF防治CHF的分子生物學機制，進一步開發(fā)RLF這一經(jīng)濟、有效、低毒的抗心衰中藥提供了重要的理論依據(jù)。

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