李海燕 曹勵(lì)民 王 娟 (西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 7002)

臨床資料顯示，約60%以上的肝癌(含早期肝癌)確診時(shí)已發(fā)生臨床或顯微鏡下轉(zhuǎn)移〔1〕。因此抗侵襲轉(zhuǎn)移，減少術(shù)后復(fù)發(fā)成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。三氧化二砷(As2O3)是砒霜的主要成分，已成功應(yīng)用于急性早幼粒白血病(APL)的臨床治療，也已用于治療胃癌、頭頸 部癌和食管癌等實(shí)驗(yàn)研究〔2，3〕。新近研究發(fā)現(xiàn)，AS2O3有可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。本文對(duì)其體外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 As2O3(哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司)，臨用前用1640培養(yǎng)基稀釋至所需要濃度。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，Transwell小室(3428型)(Coming公司)，Matrigel(5 g/L)(BD 公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，F(xiàn)luorophore Sybr Green(Netherlands公司)。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，MMP-9、α-tublin一抗(美國(guó) ABCAM 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱單層傳代培養(yǎng)。每2～3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，接種于96孔板，每孔200 μl，5 000個(gè)細(xì)胞/孔，孵育24 h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后棄上清，更換新鮮的培養(yǎng)液，180 μl/孔并加入20 μl的各濃度藥液，含 As2O3分別為1，2，4 μmol/L，空白對(duì)照僅加入 20 μl培養(yǎng)基，每組 6 個(gè)復(fù)孔，置搖床上低速振蕩混勻，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入20 μl/孔MTS/PMS溶液，MTS的終質(zhì)量濃度為333 μg/ml，PMS的終濃度為25 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后置搖床上低速振蕩10 min，測(cè)量各孔在490 nm處的吸光值。

1.2.3 劃痕愈合法測(cè)定細(xì)胞遷移能力試驗(yàn) 將2×106個(gè)SMMC-7721細(xì)胞接種在6孔板，培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h;用10 μl移液器的槍頭沿培養(yǎng)板底部做“十”字劃痕，劃痕時(shí)要以直尺定位，盡量使劃痕垂直于之前所做的定位橫線(xiàn)。無(wú)血清培養(yǎng)液基洗3次，換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，加入As2O3調(diào)節(jié)濃度為2.0 μmol/L。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h，24 h后，倒置顯微鏡觀(guān)察并拍照，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行樣本。

1.2.4 Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲能力 將Transwell放入24孔板內(nèi)，Matrigel與無(wú)血清培養(yǎng)基1∶9配制，Transwell上層鋪50 μl稀釋的Matrigel，37℃過(guò)夜至 Matrigel膠凝固，種植細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)，無(wú)血清培養(yǎng)基300 μl，加入As2O3，調(diào)節(jié)藥物濃度為2.0 μmol/L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。在12 h，24 h分別取出小室，以PBS清洗3次，用棉簽小心刮除濾膜上面的細(xì)胞，膜下面細(xì)胞用甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次。倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 以2.0 μmol/L As2O3處理細(xì)胞，在各時(shí)間點(diǎn)以Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒要求，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。α-tublin，MMP-9基因引物及內(nèi)參GAPDH基因引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)參考相關(guān)文獻(xiàn)〔4，5〕，引物經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定其合理性后生成。MMP-9正義鏈:TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA，反 義 鏈:CGCCACGAGGAACAAACTGTAT;GAPD正義鏈:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反義鏈:TGGTGAAGACGCCAGTGGA。使用儀器CFD3120 MiniOpticon Detector(BIO-RAD，California，USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR，按照儀器使用說(shuō)明書(shū)及其軟件進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)置。每個(gè)循環(huán)末自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果應(yīng)用GraphPad.Prism.v5.0.軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法計(jì)算〔6〕。

1.2.6 Western印跡 以2.0 μmol/L As2O3處理細(xì)胞，在各時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解提細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)定量變性后上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，半干轉(zhuǎn)膜90 min。將轉(zhuǎn)有蛋白條帶的膜常規(guī)封閉、洗膜后分別與特異性一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果處理，數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響 未處理組與1、2和4 μmol/L AS2O3組SMMC-7721細(xì)胞增殖率分別為96%、80%、62%及31%;與未處理組比較，2和 4 μmol/L AS2O3組SMMC-7721細(xì)胞的增殖率明顯降低(P＜0.01)。

2.2 As2O3對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響 圖1所示，未處理的SMMC-7721在12 h，24 h，細(xì)胞劃痕距離較0 h明顯減少(P＜0.05)，表明SMMC-7721細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。2.0 μmol/L As2O3處理與未處理的SMMC-7721細(xì)胞在0 h劃痕距離較一致，而處理12 h，24 h后，較未處理組明顯增加(P＜0.05)，可呈時(shí)間依賴(lài)性抑制SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力。

圖1 三氧化二砷對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響

圖2 三氧化二砷對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 As2O3對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響 圖2可見(jiàn)，2.0 μmol/L As2O3處理SMMC-7721細(xì)胞12 h與24 h后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(35.9±0.36)、(25.5±0.62)個(gè)，較未處理組的(55.6±0.48)、(42.3±0.52)個(gè)明顯減少(P＜0.05)，表明As2O3可呈時(shí)間依賴(lài)性降低SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力。

2.4 As2O3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量 PCR 顯示，2.0 μmol/L As2O3處理SMMC-7721細(xì)胞6 h，12 h與24 h后，MMP-9 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(10.08±0.15，6.54±0.13，4.02±0.05 vs 17.12±0.25，P＜0.05);Western印跡顯示，2.0 μmol/L As2O3處理 SMMC-7721 細(xì)胞 12 h，24 h 與48 h后，MMP-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(0.84±0.23，0.82±0.21，0.52±0.02 vs 0.95±0.17，P＜0.05)。表明As2O3可呈時(shí)間依賴(lài)性明顯下調(diào)MMP-9。見(jiàn)圖3。

圖3 三氧化二砷對(duì)SMMC-7721 MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。研究尋找有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)〔7～9〕。阻斷腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和遷移過(guò)程的各環(huán)節(jié)均有可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移〔10～14〕。

As2O3具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡與誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制端粒酶作用，近來(lái)不少學(xué)者也進(jìn)行 了相關(guān)研究，提示As2O3也有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用〔15，16〕，有望作為一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物運(yùn)用于臨床。

MMP-9是相對(duì)分子量最大的基質(zhì)金屬酶，主要降解和破壞Ⅳ型膠原。Ⅳ型膠原是阻礙腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵屏障基底膜的主要成分，因此，MMP-9被認(rèn)為是腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子。MMP-9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用，還包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和促進(jìn)腫瘤血管的生成。

本研究結(jié)果表明，As2O3可呈劑量依賴(lài)性抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，呈時(shí)間依賴(lài)性抑制其遷移與侵襲，從mRNA與蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性下調(diào)MMP-9。上述結(jié)果提示，As2O3抑制SMMC-7721細(xì)胞遷移與侵襲可能與下調(diào)MMP-9有關(guān)。進(jìn)一步研究As2O3抑制人肝癌細(xì)胞遷移與侵襲，闡明其詳細(xì)分子機(jī)制，對(duì)As2O3抑制肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用具有重要意義。

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