盧興兵，練正秋，白莉莎

（成都市第三人民醫(yī)院，成都 610031）

肝纖維化是所有慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)與必經(jīng)階段，是由炎性刺激導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化后，合成并分泌以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積于肝所致。HSCs活化是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是各種病因肝纖維化發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié)，一直是近年的研究熱點(diǎn)。由于肝纖維化在進(jìn)入肝硬化前尚可逆轉(zhuǎn)，因此，開(kāi)發(fā)有效的治療肝纖維化的藥物對(duì)預(yù)防慢性肝病的進(jìn)一步發(fā)展十分重要［1，2］。羊蹄根為蓼科多年生草本植物羊蹄的干燥根，始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，經(jīng)成分預(yù)試含蒽醌類(lèi)、皂苷類(lèi)、揮發(fā)油及油脂等類(lèi)物質(zhì)，其單味湯劑可治療咯血、吐血和衄血，臨床應(yīng)用多為復(fù)方制劑［3］。本文旨在探討羊蹄根對(duì)體外HSCs增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

DMEM培養(yǎng)基、DMSO和0.25%肝星狀胰蛋白酶-EDTA（均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司），肝星狀細(xì)胞株、胎牛血清（杭州四季青），MTT試劑（購(gòu)于美國(guó)sigma）；thermo細(xì)胞培養(yǎng)箱，奧林巴斯倒置相差顯微鏡；thermo加樣器，（BIO-RAD company）酶標(biāo)儀，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、羊蹄根制劑（由吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將剛復(fù)蘇的HSCs接種在含10%胎牛血清、100U/mL二抗溶液（終濃度為青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于5%CO237℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期并貼滿整個(gè)瓶底時(shí)，0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)，調(diào)配細(xì)胞濃度為105/m并轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100μL HSCs懸液。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后同步分為對(duì)照組和羊蹄根不同劑量組A1、A2、A3，每組10個(gè)平行孔。然后，更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8h后，每孔均加入10μL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）于5%CO237℃條件下培養(yǎng)12h后，分別加入A1（1∶1 200）、A2（1∶1 800）和 A3（1∶2 400）3種不同濃度的羊蹄根溶液10μL誘導(dǎo)48h。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 待細(xì)胞貼壁同步誘導(dǎo)48h后，每孔加入MTT 20μL培養(yǎng)4h后，棄上層培養(yǎng)基后每孔加入150μL DMSO液，置于振蕩器上充分震蕩10min，通過(guò)酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)取每孔吸光度（OD）值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率IE（%）＝（1－ODn/OD0）×100%，其中IE表示藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制率，OD0表示對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值，ODn表示某濃度下的吸光度值。

1.2.3 相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 在倒置相差顯微鏡下觀察對(duì)照組、羊蹄根不同劑量組處理前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)羊蹄根對(duì)HSCs的增殖情況

與對(duì)照組比較，羊蹄根組OD值顯著下降（P＜0.05），各劑量對(duì)HSCs的增殖均有顯著抑制作用（P＜0.05），并且高劑量組（A1）與中（A2）、低（A3）劑量組相比OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但中劑量組A2與低劑量組A3相比OD值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），隨著羊蹄根濃度的增加，HSCs增殖抑制率也逐漸升高，3組抑制率分別為69.36%、32.01%和29.14%（見(jiàn)表1）。

表1 羊蹄根對(duì)體外HSCs增殖的影響（±s）

表1 羊蹄根對(duì)體外HSCs增殖的影響（±s）

與對(duì)照組相比，＊P＜0.05；與高劑量組A1相比，＃P＜0.01

組別 n IE/% OD值10 - 0.731±0.117 A1（1∶1 200） 10 69.36 0.224±0.037＊A2（1∶1 800） 10 32.01 0.497±0.031＊＃A3（1∶2 400） 10 29.14 0.518±0.033＊＃對(duì)照組

2.2 羊蹄根對(duì)HSCs的細(xì)胞形態(tài)變化

經(jīng)過(guò)復(fù)蘇、傳代后，HSCs體外生長(zhǎng)穩(wěn)定，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞典型星芒狀及梭形，少數(shù)細(xì)胞間有偽足相互連接，偶見(jiàn)細(xì)胞融合成片，細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰、可見(jiàn)胞核（見(jiàn)圖1）。加入TGF-β刺激后，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞密度增加，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞之間相互連接并大量融合，細(xì)胞輪廓模糊、胞內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多，隨著時(shí)間的推移，HSCs融合成片聚集、結(jié)構(gòu)完全破壞，整個(gè)背景臟亂（見(jiàn)圖2、3）。加入羊蹄根藥物干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化：細(xì)胞由典型的星形變成了橢圓形或梭形，細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞之間偽足連接少見(jiàn)，融合基本消失，隨著羊蹄根濃度的增加，HSCs細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)差異（見(jiàn)圖4、5、6）。

3 討論

目前，世界范圍內(nèi)每年約有0.5萬(wàn)～1.2萬(wàn)人因感染乙肝病毒而死亡［4］。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，由于肝炎病毒早期臨床表現(xiàn)及癥狀不明顯，當(dāng)就診時(shí)卻已經(jīng)發(fā)展為慢性肝炎，加上地區(qū)醫(yī)療條件和自身的不重視而未得到及時(shí)有效的診斷治療，在各種慢性肝病進(jìn)展中，肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，導(dǎo)致過(guò)量的ECM在肝內(nèi)沉積，最終肝細(xì)胞逐漸纖維化，嚴(yán)重時(shí)發(fā)展為肝硬化、肝癌［5］，因此肝纖維化具有較高的致病率和病死率［6］。研究［7］表明肝纖維化是肝組織對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是大多數(shù)慢性肝病共同的病理特征，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化進(jìn)程可逆，預(yù)防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環(huán)節(jié)。HSCs活化是肝纖維化形成的重要因素之一，由于人肝纖維化細(xì)胞的獲取困難，大鼠HSCs與人HSCs在生長(zhǎng)習(xí)性、形態(tài)及結(jié)構(gòu)上相似度很高，細(xì)胞株穩(wěn)定性好，適合長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，加之在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，TGF-β起重要調(diào)節(jié)促進(jìn)作用［8］，通過(guò)加入 TGF－β來(lái)刺激HSCs活化合成大量的ECM，激活的HSCs自身也能合成、分泌TGF－β。為此，本組實(shí)驗(yàn)采用大鼠HSCs細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代后，在TGF－β刺激下最終成為羊蹄根對(duì)HSCs增殖影響的理想細(xì)胞模型。目前，有關(guān)中藥抗纖維化治療的研究很多，也取得了一定成績(jī)，但有關(guān)羊蹄根中藥對(duì)抗纖維化方向的研究卻很少。

圖1 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前 圖2 TGF-β刺激后 圖3 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后 圖4 A1組（1∶1 200） 圖5 A2組（1∶1 800） 圖6A3組（1∶2 400）

本研究通過(guò)體外復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)HSCs細(xì)胞株后，加入不同濃度的羊蹄根進(jìn)行干預(yù)。與對(duì)照組相比，羊蹄根實(shí)驗(yàn)組能夠有效抑制HSCs增殖，逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞纖維化，具有一定的抗纖維化療效。不同濃度梯度的羊蹄根對(duì)HSCs增殖抑制效果也有差異，高劑量組（A1）與中（A2）、低（A3）劑量組相比 OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而中劑量組A2與低劑量組A3之間的抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)鏡下觀察A1組可見(jiàn)：細(xì)胞由之前的星形、梭形轉(zhuǎn)變成了橢圓形，凋亡細(xì)胞增多，活細(xì)胞數(shù)目顯著減少，有效抑制了HSCs增殖且抑制率高達(dá)69.36%。隨著羊蹄根濃度的降低，A2、A3組相比對(duì)照組而言，HSCs增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制率分別為32.01%和29.14%，HSCs形態(tài)也發(fā)生了顯著逆轉(zhuǎn)，但干預(yù)效果不及高劑量A1組。總體說(shuō)明肝細(xì)胞纖維化得到有效逆轉(zhuǎn)，延緩了HSCs纖維化的進(jìn)一步惡化。

本研究結(jié)果表明：羊蹄根對(duì)HSCs增殖具有顯著的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用也在增強(qiáng)，抑制率也相應(yīng)升高，有效逆轉(zhuǎn)了HSCs纖維化。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未能探討出羊蹄根藥物抑制HSCs增殖的具體作用機(jī)制，其藥理治療機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討研究，以便為以后羊蹄根的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

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