呂麗艷 夏美玲 姚淑娟 劉伯陽 溫達靜
胃癌的發(fā)病率和病死率有著明顯的地域性,主要分布在亞洲的一些國家,例如日本、中國和其他東亞國家,有較大的危害性[1]。而感染幽門螺桿菌(Hp)是胃潰瘍、十二指腸潰瘍及原發(fā)性胃癌的主要致病因素。根治Hp是預(yù)防潰瘍和胃癌的主要臨床策略。甲硝唑作為以往最有效的治療藥物在臨床出現(xiàn)較多耐藥病例,這給Hp的防治帶來較大麻煩[2]。發(fā)現(xiàn)耐藥菌株和正常感染菌株的差異,尋找更為有效的治療策略成為當(dāng)前研究者普遍研究的熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥標(biāo)記物的篩選中、藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及臨床疾病的早期診斷中。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),如高壓液相色譜、二維電泳、表面增強激光電離質(zhì)譜等,在生物學(xué)領(lǐng)域越來越多地發(fā)揮著重要作用。本實驗應(yīng)用二維電泳串聯(lián)MALDI-TOF的方法,分析正常Hp菌與耐甲硝唑Hp菌的蛋白表達差異,從而為發(fā)現(xiàn)藥物靶點提供理論和實驗依據(jù)。
1.1 實驗菌株 Hp 26695菌株(上海第二醫(yī)科大學(xué)惠贈)。
1.2 實驗儀器與試劑 質(zhì)譜儀美國AB公司VOYAGER Biospeetromet;雙向凝膠電泳儀器:安瑪西亞有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三輕甲基胺基甲烷(TriS)、甘氨酸、漠酚藍、乙二胺四乙酸均購自德國Merck公司;碘乙酞胺(IAM)、低熔點瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司;甲酸、碳酸氫銨從美國Fisher公司購買;測序級胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑Roehe公司購買;線性IPG膠條購自GE Healtheare Amersham公司。其他化學(xué)試劑主要購于本地化學(xué)試劑公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 抗甲硝唑Hp誘導(dǎo) 將Hp 26695接種于瓊脂平板,置于37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng),接種于含不同濃度甲硝唑(1,2,4,8,16μg/mL)的液體培養(yǎng)基中,置于微需氧環(huán)境培養(yǎng)72h,觀察Hp是否被抑制,選出耐藥株。然后在不含甲硝唑的培養(yǎng)基中連續(xù)傳3次,檢測耐藥性形成的穩(wěn)定性。
1.3.2 樣品制備 正常和耐藥Hp分別培養(yǎng)于大約20個9cm×9cm平板,微需氧條件培養(yǎng),收集細菌,7000g,離心30min,收集沉淀,提取總蛋白,通過2-DE技術(shù)分離,凝膠顯色,得到蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜,利用Image Master軟件進行圖像分析,尋找敏感株與耐藥株的差異性蛋白質(zhì)斑點。以2倍或2倍以上變化的為差異點,共29個點進行質(zhì)譜鑒定。
1.3.3 質(zhì)譜檢測 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀進行差異點鑒定。通過分析軟件分析得到的質(zhì)譜結(jié)果。
1.3.4 數(shù)據(jù)庫檢索 UCSF數(shù)據(jù)庫檢索蛋白功能。
2.1 敏感hp株與耐甲硝唑Hp株二維電泳結(jié)果見圖1、2。
圖1 敏感Hp二維電泳圖
圖2 耐藥Hp二維電泳圖
2.2 通過軟件分析,差異點大于等于2倍的凝膠通過MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定,我們共發(fā)現(xiàn)27個差異蛋白質(zhì)。耐藥菌株與敏感菌株相比,8個蛋白表達下降,19個表達上升。功能涵蓋:熱休克蛋白、細胞呼吸鏈相關(guān)酶類、細胞壁及鞭毛合成的部分結(jié)構(gòu)蛋白、金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白和DNA突變蛋白等功能性蛋白質(zhì)。主要蛋白的質(zhì)譜信息,見表1。部分質(zhì)譜檢測結(jié)果見圖3、4。
圖3 蛋白UvrABC system protein A質(zhì)譜鑒定圖
圖 4 蛋白Chaperone protein HtpG質(zhì)譜鑒定圖
表1 差異蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果
目前世界范圍內(nèi)根治Hp感染的方案主要是抗生素聯(lián)合治療。2種或3種抗生素共同作用可以有效根除Hp,但是目前臨床的抗藥性情況越來越嚴(yán)重,使醫(yī)務(wù)工作者們不得不關(guān)注抗藥性產(chǎn)生的各種相關(guān)因素。其中耐甲硝唑Hp的臨床研究是主要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn)Hp對甲硝唑的耐藥機制與rdxA、frxA和fdxB基因突變相關(guān),其中rdxA基因編碼對氧不敏感的NADPH硝基還原酶,frxA編碼NADPH flavin oxidoreductase,fdxB編碼ferredoxin-like protein蛋白。
本研究中發(fā)現(xiàn),耐藥Hp菌株與敏感株比較,表達水平增高的蛋白主要的是Chaperone protein HtpG、(一種熱休克蛋白)、UvrABC system protein A、Transcription-repaircoupling factor(UvrB family,破壞DNA 結(jié)構(gòu))、adenosine tRNA methylthiotransferase MiaB(離子轉(zhuǎn)運)、Flagellar hook-associated protein 2(鞭毛形成),Protein translocase subunit SecA(ATP結(jié)合和金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白)、NADP-specific glutamate dehydrogenase、Uracil-DNA glycosylase、MutS2 protein等,可以分析得出結(jié)論:耐甲硝唑Hp菌株應(yīng)變外界變化,熱休克蛋白增加;而抗生素的外界壓力誘使細菌DNA突變和錯配率升高;為了更好定植,鞭毛形成蛋白也起到錨定的作用,對抗外界環(huán)境變化;同時為了更好地適應(yīng)外界抗生素環(huán)境,細菌需要更強的呼吸作用,所以一些和呼吸相關(guān)的酶類數(shù)量上升較為明顯。
本研究中同時發(fā)現(xiàn),耐藥菌株與敏感株比較表達水平降低的蛋白質(zhì)主要是Uncharacterized aminotransferase HP_0736、Elongation factor G、Protein translocase subunit SecA ATP、Translation initiation factor IF-2、Histidine-tRNA ligase、Molybdopterin synthase catalytic subunit等,主要的都是擔(dān)任細菌分解作用的和代謝有關(guān)的酶類,可以推論細菌在適應(yīng)外界抗生素環(huán)境時,分解和代謝能力下降,以適應(yīng)外界不良環(huán)境。這些結(jié)果與一些文獻[3-4]的研究有部分被提及,但本文發(fā)現(xiàn)的引起DNA錯配和突變蛋白質(zhì)如:MutS2 protein,及部分代謝類蛋白質(zhì)尚無報道。有待進一步研究探索。
總之,研究本文相關(guān)功能蛋白質(zhì)變化情況可以得出結(jié)論,敏感菌株和耐甲硝唑Hp中相關(guān)基因已經(jīng)發(fā)生突變,其中呼吸鏈相關(guān)蛋白和金屬轉(zhuǎn)運蛋白,熱休克蛋白可以進一步進行功能研究,從而篩選耐甲硝唑菌株差異的相關(guān)蛋白作為藥物靶點[5]:例如DNA突變和錯配的蛋白質(zhì)MutS2 protein可以考慮作為抗藥靶點,從而為科研及臨床Hp治療提供有力的理論依據(jù)和研究方向。
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