郭海峰

（河南科技大學(xué)體育學(xué)院，河南洛陽471022）

過氧化物酶體增生物受體γ共激活因子－1α（peroxisome proliferator－activated receptorγcoactivator－1α，PGC－1α）是線粒體生物合成、細(xì)胞呼吸和能量底物利用的重要調(diào)節(jié)因子［1］。研究顯示在Ⅱ型糖尿病患者及不參加體力活動(dòng)人群的骨骼肌內(nèi)PGC－1α蛋白表達(dá)量下降［2］，運(yùn)動(dòng)能夠提高骨骼肌PGC－1α基因和蛋白的表達(dá)［3］，而骨骼肌中 PGC－1α的高表達(dá)則能大幅提高骨骼肌GLUT4的表達(dá)和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率［4］。因此，PGC－1α在提高骨骼肌葡萄糖攝取速率以及降低血糖含量方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。

PGC－1α基因的啟動(dòng)子上含有保守肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）結(jié)合位點(diǎn)和環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件（c－AMP response element，CRE）序列［5］，生理刺激條件下此兩段序列通過與相應(yīng)的結(jié)合蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而參與調(diào)節(jié)PGC－1α的轉(zhuǎn)錄［6］。MEF2和CRE位點(diǎn)的變異會(huì)抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)對(duì)PGC－1α刺激的響應(yīng) ，提示了PGC－1α的轉(zhuǎn)錄激活依賴于 MEF2和CRE與PGC－1α啟動(dòng)子的功能性交互作用。轉(zhuǎn)錄激活因子2（activating transcription factor－2，ATF－2）和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP－response element binding protein，CREB）主要通過結(jié)合CRE序列而參與調(diào)節(jié)PGC－1α基因轉(zhuǎn)錄［7］。研究顯示，骨骼肌內(nèi)腺苷酸活化蛋白激酶（5′－AMP activated protein kinase，AMPK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）不僅可以直接磷酸化參與調(diào)節(jié)PGC－1α轉(zhuǎn)錄的CRE結(jié)合蛋白 AFT－2和CREB，還可以直接磷酸化PGC－1α通過自我調(diào)節(jié)機(jī)制提高PGC－1α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活［8］。以往研究結(jié)果顯示，骨骼肌能量攝取速率在肌肉活動(dòng)時(shí)有強(qiáng)度依賴性，而相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路也會(huì)按照運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度被有區(qū)別的調(diào)節(jié)［9］。然而，是否這些信號(hào)傳導(dǎo)通路有區(qū)別的激活會(huì)引起下游基因靶分子PGC－1α以及其轉(zhuǎn)錄過程呈強(qiáng)度依賴性調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。本研究的目的在于探討不同強(qiáng)度的急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌PGC－1α表達(dá)，以及參與調(diào)節(jié)PGC－1α表達(dá)的信號(hào)分子 AMPK、p38MAPK、ATF－2及CREB磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡的 Wistar大鼠（178g±4g）48只。試驗(yàn)期間，室內(nèi)溫度保持在20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，每天光照12h。正常飼養(yǎng)的1周內(nèi)所有大鼠自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠隨機(jī)分成安靜對(duì)照組（C）和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（E）。其中安靜對(duì)照組12只，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組36只。

1.1.2 試驗(yàn)分組 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組大鼠再隨機(jī)分為低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（low intensity exercise group，LE）、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（moderate intensity exercise group，ME）和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（high intensity exercise group，HE），每組12只，并分別于試驗(yàn)前按所設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間進(jìn)行1次～2次適應(yīng)性跑臺(tái)練習(xí)。

1.1.3 運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)和取材 跑臺(tái)訓(xùn)練組大鼠運(yùn)動(dòng)方式采用0坡度的1h跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。跑臺(tái)速度為低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組12m／min（約55%VO2max），中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組28m／min（約75%VO2max），高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組34m／min（約85%VO2max）［10］。運(yùn)動(dòng)組大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后3h取材（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，蛋白和mRNA表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后3h均顯著增加）。腹腔注射烏拉坦（注射標(biāo)準(zhǔn)為5mL／kg體重）麻醉后，取雙側(cè)股四頭肌，迅速投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 儀器設(shè)備及試劑 PCR擴(kuò)增儀（GT9631），購自杭州柏恒科技有限公司；RT－PCR試劑盒，F(xiàn)ermentas；7300熒光定量PCR儀和熒光染料反應(yīng)體系（SYBR○RGreen PCR Master Mix，美國 Applied Biosystems）；蛋白酶抑制劑混合物，購于Pierce公司；BCA蛋白定量試劑盒，購于Pierce公司；一抗［（Phospho－AMPKα （Thr172）， MA； Phosphop38MAPK，Mouse mAb，Cell Signaling Technology；PGC－1α，rabbit polyclonal IgG，Abcam；Phospho－ATF－2Thr172，rabbit monoclonal IgG；Phospho－CREB Ser133，rabbit monoclonal IgG，Cell Signaling Technology］；二 抗 （Goat Anti－rabbit IgG，HRP－linked Antibody，Cell Signaling Technology；Goat anti－mouse IgG，HRP－linked Antibody，上海迪奧公司）；內(nèi)參（β－actin，rabbit polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取骨骼肌總mRNA－肌肉組織80mg于液氮研磨成粉末狀，投入裝有1mL Trizol（Invitrogen）試劑的離心管中，12 000r／min、4℃離心約10min。取上清400μL至新離心管，于室溫靜置5min。加入200μL氯仿，混勻，室溫放置2min后，12 000r／min、4℃離心30min。取上清移至新離心管，加入等體積異丙醇600μL，混勻，室溫放置10min后，12 000r／min、4℃離心10min。棄上清，1mL 700mL／L乙醇（去DEPC水配制）漂洗沉淀后，7 500r／min、4℃離心5min。棄去70mL／L乙醇，超凈臺(tái)自然風(fēng)干，加20μL DEPC水溶解沉淀。8g／L瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA完整性以及濃度和純度。

對(duì)于PGC－1αmRNA的表達(dá)，本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量（Real－time PCR）兩步法進(jìn)行。第一步，逆轉(zhuǎn)錄（RT）部分。使用PCR擴(kuò)增儀和RT－PCR試劑盒，按照RecertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成的cDNA于－20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫╩RNA不穩(wěn)定，所以該步驟要在取材后3d內(nèi)完成）。熒光定量檢測(cè)部分使用7300熒光定量PCR儀和熒光染料反應(yīng)體系。用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由寶生物工程（大連）有限公司合成。具體上、下游引物序列為：PGC－1αa，5′－ACGGGATGTGGTAGATCGTG－3′；PGC－1αs，5′－GGCGACGTTAGTAAGTGGCT－3′。實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)值由StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied biosystems）讀取。目標(biāo)基因＝2－△△CT。

1.2.2 Western blot 骨骼肌 Phospho－AMPKα、Phospho－p38MAPK、PGC－1α 等 蛋 白 表 達(dá) 采 用Western blot測(cè)定。股四頭肌大約100mg置于1mL蛋白裂解液中（50mmol／L Tris－HCl，pH 7.4～8.0，150mmol／L NaCl，5mmol／L EDTA，10g／L Triton－X－100，5μL 100×蛋白酶抑制混合物），4℃條件下電動(dòng)勻漿機(jī)充分勻漿后，4℃、14 000r／min離心5min后，取上清保存于－80℃。采用Pierce公司的BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

依據(jù)蛋白含量調(diào)整蛋白上樣量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白（p－AMPKα、pp38、PGC－1α等）和內(nèi)參蛋白（β－actin），轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（Millipore），采用50g／L的脫脂奶粉封閉50min，一抗4℃過夜。二抗和內(nèi)參孵育1h，洗滌，然后X光片（Kodak）暗室曝光、顯影、定影。用生物電泳圖像分析軟件（FR－980Smart View，復(fù)日科技）對(duì)曝光所得X片進(jìn)行拍照，使用Quality one軟件讀取目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的積分灰度值，結(jié)果用目的蛋白積分灰度值與內(nèi)參積分灰度值的比值表示。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±SD）表示。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 15.0分析軟件。同一指標(biāo)之間比較采用單因素方差分析。顯著性水平用P＜0.05和P＜0.01為表示。

2 結(jié)果

2.1 PGC－1αmRNA表達(dá)

由圖1看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著增加，差異極顯著（P＜0.01）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表達(dá)顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05），高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表達(dá)與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)PGC－1αmRNA表達(dá)的影響Fig.1 The effect of a bout of exercise on PGC－1αmRNA expression

2.2 骨骼肌內(nèi)PGC－1α蛋白表達(dá)

由圖2看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著增加。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)顯著高于中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.01）。

2.3 骨骼肌 AMPKα（Thr172）磷酸化水平

由圖3看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌內(nèi)AMPKα磷酸化水平與對(duì)照組相比均顯著升高，且均呈極顯著性差異（P＜0.01）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠AMPKα磷酸化水平與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，呈極顯著性差異（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of PGC－1αin skeletal muscle of rats of various groups

圖3 各組大鼠骨骼肌AMPKα（Thr172）磷酸化水平Fig.3 Phosphorylatiion levels of AMPKα（Thr172）in skeletal muscle of rats of various groups

2.4 骨骼肌p38MAPK蛋白磷酸化水平

由圖4看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌內(nèi)p38MAPK磷酸化水平與對(duì)照組相比均顯著升高，且均呈極顯著性差異（P＜0.01）。不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠p38MAPK磷酸化水平相比均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠骨骼肌p38MAPK磷酸化水平Fig.4 Phosphorylatiion levels of p38MAPK （PP38）in skeletal muscle of rats of various groups

2.5 骨骼肌ATF－2磷酸化水平

由圖5看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，雖然低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比沒有顯著性差異，中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比均顯著升高。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平顯著高于中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平Fig.5 Phosphorylatiion levels of ATF－2in skeletal muscle of rats of various groups

2.6 骨骼肌CREB磷酸化水平

由圖6看出，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，雖然低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比沒有顯著性差異，中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比均顯著升高。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖6 各組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平Fig.6 Phosphorylatiion levels of CREB in skeletal muscle of rats of various groups

3 討論

3.1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)PGC－1α表達(dá)的影響

PGC－1最先是采用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠的棕色脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)PPARγ的轉(zhuǎn)錄，因此得名過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1。目前發(fā)現(xiàn)的PGC－1家族成員有PGC－1α、PGC－1β和 PGC－1相關(guān)共激活因子（PGC－1－related coactivator，PRC）。PGC－1α在能量代謝主要場(chǎng)所及富含線粒體的骨骼肌中高表達(dá)。研究顯示PGC－1α可以通過協(xié)同激活肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2高效誘導(dǎo)GLUT4基因的表達(dá)而提高肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力，從而降低血糖 。由此可見，PGC－1α的表達(dá)下降，必然引起GLUT4表達(dá)的下降，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺陷，血糖升高。

大量研究表明，運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)PGC－1α基因和蛋白的表達(dá)，這對(duì)于改善胰島素水平及降低糖尿病人血糖濃度等方面有著重要的意義。David C W等［11］的研究發(fā)現(xiàn)大鼠6h游泳運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌PGC－1α蛋白含量顯著增加。Terada A S等［12］讓大鼠進(jìn)行每次3h、中間休息45min總共6h的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后發(fā)現(xiàn)，四頭肌PGC－1α蛋白表達(dá)量增加了75%。本試驗(yàn)中大鼠1h一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌PGC－1αmRNA和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增加，與以往研究結(jié)果相一致。另有研究報(bào)道顯示運(yùn)動(dòng)引起的PGC－1αmRNA表達(dá)增加具有時(shí)相性［13］。通常表現(xiàn)為一次性運(yùn)動(dòng)后，PGC－1αmRNA即刻增加，運(yùn)動(dòng)后3h顯著增加，運(yùn)動(dòng)后15h才達(dá)到頂峰，運(yùn)動(dòng)后18h與安靜對(duì)照相比仍有顯著性差異。

雖然目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)PGC－1α的影響研究比較成熟，但目前研究多集中于不同的運(yùn)動(dòng)形式對(duì)運(yùn)動(dòng)后的時(shí)相性變化規(guī)律，而關(guān)于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是否對(duì)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌PGC－1α表達(dá)產(chǎn)生影響，目前尚不清楚。本研究假設(shè)大鼠不同強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后PGC－1α基因和蛋白表達(dá)量增加量由于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的差異而各不相同。研究結(jié)果顯示，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表達(dá)顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1αmRNA表達(dá)與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，呈極顯著性差異，與我們?cè)囼?yàn)假設(shè)運(yùn)動(dòng)引起的PGC－1α表達(dá)增加具有強(qiáng)度依賴性相一致。另外，雖然高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，而中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌PGC－1α蛋白表達(dá)與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比沒有顯著性差異，其原因尚不明確。但有研究報(bào)道稱，由于細(xì)胞蛋白表達(dá)受多重調(diào)節(jié)步驟的限制（如基因轉(zhuǎn)錄、mRNA的穩(wěn)定性、蛋白翻譯效率、蛋白翻譯的修飾及蛋白降解等），同一運(yùn)動(dòng)模型中能量代謝蛋白表達(dá)通常要晚于基因轉(zhuǎn)錄［14］。本研究在運(yùn)動(dòng)后3h取材，PGC－1α蛋白的含量增加可能并沒有到達(dá)穩(wěn)定增加的時(shí)間范圍。

3.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)p38磷酸化水平的影響

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，p38可以直接磷酸化PGC－1，并引起PGC－1轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的抑制劑－p160結(jié)合蛋白釋放，使PGC－1活動(dòng)增強(qiáng)，而抑制p38活性則會(huì)阻斷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的PGC－1表達(dá)。雖然這些研究結(jié)果提示了p38是PGC－1的上游激酶，但是一直沒有證據(jù)表明p38可以促進(jìn)骨骼肌PGC－1α基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)。直到2005年，Akimoto T等［15］利用高表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在C2C12肌肉細(xì)胞中高表達(dá)p38，能引起細(xì)胞內(nèi)PGC－1轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。研究人員推測(cè)p38的激活可能通過磷酸化ATF－2，然后ATF－2結(jié)合并激活PGC－1啟動(dòng)子上的CRE結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)PGC－1表達(dá)增加。而David C等［16］的研究結(jié)果表明大鼠游泳運(yùn)動(dòng)后，p38磷酸化和ATF－2磷酸化水平均顯著增加，可能為此推測(cè)提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

研究表明，不論是急性運(yùn)動(dòng)，還是耐力性運(yùn)動(dòng)都能顯著激活p38［15］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌內(nèi)p38磷酸化水平與對(duì)照組相比均顯著升高，且均呈非常顯著性差異，與前人研究結(jié)果一致。但本試驗(yàn)中不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌內(nèi)p38磷酸化水平相比，并無顯著性差異，提示p38對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的敏感性較差。不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后p38的磷酸化水平與PGC－1αmRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)水平并不一致，則可能進(jìn)一步提示了雖然p38參與調(diào)解了運(yùn)動(dòng)后骨骼肌PGC－1α表達(dá)的增加，但并不是影響運(yùn)動(dòng)后PGC－1α表達(dá)呈強(qiáng)度依賴性的主要上游激酶。

3.3 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK磷酸化水平的影響

AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的感受器，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［17］，利用 AMPK 藥理激活劑5－氨基咪唑－4－甲酰胺核苷酸（5－amino－4－imidazolecarboxamide－riboside，AICAR）孵育大鼠骨骼肌細(xì)胞后PGC－1αmRNA表達(dá)顯著升高，且這種增加在AMPK基因敲除鼠受到抑制，提示AMPK同樣參與調(diào)控PGC－1α表達(dá)。研究顯示PGC－1α啟動(dòng)子含有保守性MEF2結(jié)合位點(diǎn)，MEF2通過結(jié)合到PGC－1α啟動(dòng)子區(qū)域MEF2結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)節(jié)PGC－1α的轉(zhuǎn)錄。安靜狀態(tài)下，MEF2與組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs）的結(jié)合抑制了MEF2對(duì)靶基因－PGC－1α的轉(zhuǎn)錄活性［18］。但是 HDACs的磷酸化可以解除其對(duì)MEF2的抑制，使MEF2發(fā)揮其對(duì)靶基因－PGC－1α的生理作用。骨骼肌內(nèi)AMPK在骨骼肌中激活以后正是通過磷酸化HDAC4和HDAC5來解除對(duì)MEF2的抑制，實(shí)現(xiàn)其對(duì)PGC－1α轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK活性的影響，目前研究結(jié)果一致認(rèn)為運(yùn)動(dòng)能夠提高AMPKα磷酸化水平。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，與對(duì)照組相比，骨骼肌內(nèi)AMPKα磷酸化水平均增加，呈非常顯著性差異，與以往研究結(jié)果相一致。另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠AMPKα磷酸化水平與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，呈非常顯著性差異，提示運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌內(nèi)AMPK激活增加同樣受運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度影響。

3.4 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)ATF－2和CREB磷酸化水平的影響

ATF－2和CREB均屬于CRE轉(zhuǎn)錄因子家族成員，兩者均與 CRE 序列 （5′－TGACGTCA －3′）有極高的親和力，并通過與之結(jié)合而調(diào)節(jié)PGC－1α的轉(zhuǎn)錄。有研究顯示ATF－2的磷酸化主要是由p38介導(dǎo)，即p38對(duì)PGC－1α的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)ATF－2與PGC－1α啟動(dòng)子上的CRE結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮生理作用，這一途徑對(duì)于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的PGC－1αmRNA表達(dá)增加至關(guān)重要。肌肉收縮或運(yùn)動(dòng)均伴隨有p38和ATF－2的激活以及PGC－1αmRNA表達(dá)增加。因此，推測(cè)運(yùn)動(dòng)引起的PGC－1αmRNA表達(dá)增加可能依賴于p38對(duì)ATF－2的磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌內(nèi)ATF－2磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比不具有顯著性差異；但中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比均顯著增加，且中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌ATF－2磷酸化水平顯著高于低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組骨骼肌ATF－2磷酸化水平顯著高于中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，提示運(yùn)動(dòng)引起的ATF－2的激活同樣受運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度影響。低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組與安靜對(duì)照組相比，大鼠骨骼肌內(nèi)ATF－2磷酸化水平?jīng)]有顯著性差異，則提示了機(jī)體可能還有其他信號(hào)通路在中強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下激活了ATF－2，而不是p38，具體機(jī)制尚不明確，但是足以證明ATF－2在運(yùn)動(dòng)后PGC－1α強(qiáng)度依賴性增加過程中起重要調(diào)節(jié)關(guān)鍵作用。

CREB是細(xì)胞內(nèi)的第三信使，定位于細(xì)胞核內(nèi)，其C端包含有一個(gè)亮氨酸拉鏈區(qū)，是CREB分子與DNA相互作用的區(qū)域，稱亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bZIP），也稱DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究顯示CREB蛋白的生物學(xué)活性受其磷酸化的調(diào)控，它是多種蛋白激酶的磷酸化底物，包括AMPK、p38。當(dāng)CREB蛋白被磷酸化后，可以被CBD蛋白特殊的結(jié)構(gòu)域特異性地識(shí)別并結(jié)合，并促使PGC－1α啟動(dòng)子序列上的CRE元件的乙?；瑔?dòng)基因轉(zhuǎn)錄。由于AMPK、P38作為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的CREB上游激酶在運(yùn)動(dòng)中均能夠被激活，因此，推測(cè)AMPK以及p38可能通過磷酸化CREB來調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)后PGC－1α基因的表達(dá)。

研究結(jié)果顯示，一次性不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，雖然低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組骨骼肌CREB磷酸化水平也有所增加，但并不顯著；雖然中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平與安靜對(duì)照組相比均顯著升高，但高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌CREB磷酸化水平與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比沒有顯著差異。這些結(jié)果提示，CREB磷酸化水平可能并不是影響運(yùn)動(dòng)后PGC－1α呈強(qiáng)度依賴性增加的主要因素。有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后19hCREB磷酸化狀態(tài)仍然保持高水平［19］，這可能是維持運(yùn)動(dòng)18h后PGC－1αmRNA高水平的主要原因 。本試驗(yàn)最終研究表明，運(yùn)動(dòng)引起的PGC－1α表達(dá)增加具有強(qiáng)度依賴性；運(yùn)動(dòng)后PGC－1α呈強(qiáng)度依賴性增加可能主要受同樣具有強(qiáng)度依賴性的AMPK以及ATF－2調(diào)節(jié)；雖然以往研究顯示p38及CREB的激活也參與調(diào)節(jié)了運(yùn)動(dòng)后PGC－1α的表達(dá)的增加，但可能并不是影響運(yùn)動(dòng)后PGC－1α呈強(qiáng)度依賴性增加的主要因素。

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