譚 心，王 和，苑天紅，馬 妍

(1.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院檢驗科，貴州遵義 563002;2.貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，貴州貴陽 550004)

近年來，隨著抗菌藥物、免疫抑制劑和激素在臨床上大量應(yīng)用，真菌感染率持續(xù)升高，其中白念珠菌是院內(nèi)感染的主要致病菌之一［1－2］。氟康唑是目前國內(nèi)治療白念珠菌感染的常用藥物之一，由于在臨床上長期應(yīng)用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，白念珠菌對氟康唑的耐藥問題日漸凸顯［3］。研究表明，中藥中大量結(jié)構(gòu)新穎、藥理活性強的化合物，在抗真菌感染中具有一定的優(yōu)勢［4－5］。目前，聯(lián)合應(yīng)用抗真菌藥物來避免耐藥性產(chǎn)生和減少藥物副作用是治療真菌感染的研究方向之一［6］。本研究將通過探討肉桂醛、鹽酸小檗堿和氟康唑單獨及其聯(lián)合抗白念珠菌的作用及其機制，為臨床上應(yīng)用中藥及中、西藥物聯(lián)合治療白念珠菌感染提供初步試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材 白念珠菌(ATCC10231)，二甲基亞砜(北京，索萊寶科技有限公司)，RNA-pure Yeast Kit酵母RNA提取試劑盒(北京，康為世紀(jì)生物科技有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒(大連，寶生物工程有限公司)，擴增引物(上海，生工生物工程有限公司)，肉桂醛、鹽酸小檗堿(陜西，慈緣生物技術(shù)有限公司，批號 CY111220和CY111215);氟康唑(江西，回音必集團東亞制藥有限公司，批號:2011041122)。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 將肉桂醛(Cinnamic aldehyde，CIN)、鹽酸小檗堿(Berberine Hydrochloride，BER)用二甲基亞砜(DMSO)分別溶解后得到母液的濃度為:12 800 μg/mL 和 25 600 μg/mL、氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LC)用三蒸水溶解后濃度為:1 280 μg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液配置 ?。?0℃凍存的白念珠菌ATCC10231菌種100 μL菌液，滴于SDA培養(yǎng)基上，用涂玻棒，將菌液均勻鋪于培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)10 min后，將培養(yǎng)皿倒置并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。連續(xù)畫線接種于新培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。直徑＞1 mm的菌落(5個單菌落)置于生理鹽水中，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋菌濃度:5×104CFU/mL。

1.2.3 3 種藥物的藥敏試驗

1.2.3.1 單藥的最低抑菌濃度(MIC)測定［7］參照美國臨床與實驗標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(NCCLS)的真菌藥物敏感性試驗(M27－A)方案的微量稀釋法步驟操作:將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑分別用 RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋，其終濃度范圍分別為:肉桂醛、鹽酸小檗堿為1 280～2.5 μg/mL，氟康唑分別為128～0.25 μg/mL。加入96孔板中，每孔100 μL藥液+100 μL含菌培養(yǎng)液。同時設(shè)立對照組。每次實驗，均設(shè)立一組質(zhì)控菌。經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。每組設(shè)3個復(fù)孔，試驗重復(fù)5次。

1.2.3.2 聯(lián)合藥敏試驗［8－9］采用棋盤微量稀釋法檢測，在96孔板上，將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑藥物原液分別用RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋，使肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑的終濃度為單用時測得該種菌株 MIC 值的 1/8、1/4、1/2、1、2、4 倍濃度。按照棋盤格法的設(shè)計方式，以縱、橫兩個方向，將不同濃度的兩種聯(lián)用藥物各50 μL加入96孔板中，每孔再加入100 μL配制好的菌懸液，分別混合后進(jìn)行藥物聯(lián)合作用。同時設(shè)陽性對照孔(100 μL含菌培養(yǎng)液+100 μL無藥培養(yǎng)液)及陰性對照孔(無菌無藥的培養(yǎng)基200 μL)，混勻。真菌培養(yǎng)步驟和藥物處理時間同上(2.3.1)。

1.2.3.3 藥物單獨及聯(lián)合作用評價［10］FIC 為兩藥物聯(lián)合抗菌時，其中單藥所需最低抑菌濃度(MIC)與藥物單用時抗菌的 MIC比值(FIC=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用);FICI為兩種藥物 FIC 之和(FIC=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用)。兩藥聯(lián)合作用時評價方式為:當(dāng)FICI≤0.5時，兩藥聯(lián)合抗菌效應(yīng)為協(xié)同作用;當(dāng)0.5＜FICI≤1時，兩藥聯(lián)合抗菌效應(yīng)為累加作用;當(dāng)1＜FICI≤2時，兩藥聯(lián)合抗菌效應(yīng)為無關(guān);FICI＞2時，兩藥的相互作用為拮抗作用。

1.2.4 3種藥物的單獨及聯(lián)合對白念珠菌PLB1 mRNA表達(dá)水平的影響:實驗設(shè)對照組、試驗組:CIN 80 μg/mL、BER 20 μg/mL、FLC 4 μg/mL、CIN 320 μg/mL、BER 80 μg/mL、FLC 16 μg/mL、CIN 80 μg/mL 與 FLC 4 μg/mL、BER 20 μg/mL 與 FLC 4 μg/mL。經(jīng)37℃培養(yǎng)6～8 h后，按照 RNApure Yeast Kit酵母RNA提取試劑盒操作方法，提取各組總RNA，測定總RNA濃度和純度，在紫外透射儀上觀察，并掃描凝膠，檢測總RNA的完整性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。采用凝膠分析軟件bandscan4.3對電泳結(jié)果分析，得到內(nèi)參TEF3、目的基因PLB1的灰度值，目的基因mRNA的相對表達(dá)量用目的基因與內(nèi)參基因條帶的灰度值的比值來表示。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 將每種藥物單用及分別聯(lián)合時MIC值轉(zhuǎn)換成對數(shù)后，進(jìn)行配對資料的t檢驗(student’s t－test)，P ＜0.05 時具有統(tǒng)計學(xué)差異。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示，首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)性和方差齊性則采用F檢驗(方差分析)，兩兩之間比較采用q檢驗，計數(shù)資料進(jìn)行x2檢驗，以P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 藥物單獨及其聯(lián)合抗白念珠菌藥敏實驗的結(jié)果 藥物單獨作用于白念珠菌時:肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑抗白念珠菌的MIC范圍分別為:160～320、80 ～160 和 8 ～16 μg/mL，其 MIC80分別為:320、80、16 μg/mL;藥物兩兩聯(lián)合作用于白念珠菌時，單藥MIC值得幾何均數(shù)均顯著減少(見表1):①CIN與FLC:CIN的MIC值幾何均數(shù)從278.85 μg/mL 降至 91.89 μg/mL(t=8.73，P ＜ 0.001)、FLC的MIC值幾何均數(shù)從13.92 μg/mL降至4.59 μg/mL(t=13.24，P ＜ 0.001);②BER 與 FLC:BER的 MIC值幾何均數(shù)從105.56 μg/mL降至22.97 μg/mL(t=11.32，P ＜ 0.001)、FLC 的 MIC值幾何均數(shù)從12.15 μg/mL降至5.27 μg/mL(t=12.23，P ＜0.001)。

表1 藥物聯(lián)合抗白念珠菌作用效果評價

2.2 藥物對白念珠菌酶相關(guān)PLB1基因mRNA表達(dá)的影響 通過RT－PCR技術(shù)，得到內(nèi)參基因TEF3和PLB1擴增產(chǎn)物分別呈517bp和416bp條帶(見圖1)，其PLB1基因在mRNA的相對表達(dá)量水平分別為(見表 2):0.950、0.903、0.847、0.849、0.794、0.781、0.708、0.536 和 0.364，低于對照組(P ＜0.05)。

表2 藥物對白念珠菌酶相關(guān)PLB1基因mRNA表達(dá)的影響(±s)

表2 藥物對白念珠菌酶相關(guān)PLB1基因mRNA表達(dá)的影響(±s)

注:*表示實驗組與對照組比較P＜0.05，表示藥物聯(lián)合組與藥物單用組比較，P＜0.05。

組 別 PLB1mRNA 表達(dá)水平Control 0.950 ±0.022*CIN 80μg/mL 0.903 ±0.031*BER 20μg/mL 0.847 ±0.018*FLC 4μg/mL 0.849 ±0.021*CIN 320μg/mL 0.794 ±0.019*BER 80μg/mL 0.781 ±0.026*FLC 16μg/mL 0.708 ±0.015*CIN 80μg/mL+BER 20μg/mL 0.631 ±0.020*CIN 80μg/mL+FLC 4μg/mL 0.536 ±0.017*BER 20μg/mL+FLC 4μg/mL 0.364 ±0.025*

圖1 各組藥物處理白念珠菌后磷脂酶基因PLB1的RT－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

目前研究認(rèn)為，磷脂酶 B(phospholipase B，Plb)是白念珠菌分泌的、與其致病性密切相關(guān)的侵襲性酶［11］。它主要通過分解宿主細(xì)胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受損，繼而促進(jìn)白念珠菌的早期入侵，目前認(rèn)為白念珠菌Plb分為Plb1、Plb2、Plb5 三個亞型［12］，其中 Plbl被認(rèn)為是最主要的致病因子，它是一種分泌型糖蛋白，同時具有水解酶和溶血磷脂轉(zhuǎn)酰酶的活性，也是白念珠菌致病所必需的毒力因子［13］。

本研究通過肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨及聯(lián)合氟康唑作用白念珠菌，對白念珠菌PLB1的表達(dá)水平進(jìn)行分析，通過采用RT－PCR方法，檢測結(jié)果顯示:肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨抗菌時，均可降低白念珠菌酶基因PLB1 mRNA的表達(dá)量，引起細(xì)胞外PL的分泌量降低，當(dāng)肉桂醛、鹽酸小檗堿分別與氟康唑聯(lián)合抗白念珠菌后，其白念珠菌酶基因PLB1 mRNA的表達(dá)量要明顯低于藥物單用。

藥物在協(xié)同作用下聯(lián)合用藥時，具有增強殺菌效果、減少藥物用量、縮短療程、同時由于其單藥的MIC聯(lián)值均比單獨抗菌時的MIC80值明顯降低，對于防治藥物的耐藥有很好的效果。由于肉桂醛和鹽酸小檗堿是中藥中的天然活性成分，植物資源豐富，且在長期臨床應(yīng)用中少見不良反應(yīng)和毒副作用。因此，肉桂醛、鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用為今后抗真菌治療提供了新的思路。

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