王 爽，范振海，王鈺瑩，喻皇飛，劉祖林，胡錫階，余麗梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099)

人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB－MSCs)的研究始于本世紀(jì)初［1］，因其具有來(lái)源廣泛、易于采集保存、不涉及倫理問(wèn)題、對(duì)產(chǎn)婦及新生兒無(wú)傷害、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，且具有向神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同胚層細(xì)胞分化的潛能［2］，因而日益受到學(xué)科界關(guān)注。但是，目前關(guān)于hUCB－MSCs的體外分離培養(yǎng)方法不一，加上臍血中所含間充質(zhì)干細(xì)胞的比例遠(yuǎn)低于骨髓，要獲得較多數(shù)量的hUCB－MSCs仍有困難。研究人員大量嘗試改進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞分離方法，不同密度接種，用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCB－MSCs等。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)是最常用的完全培養(yǎng)基中的重要添加物，近年來(lái)不少學(xué)者［3］采用人臍血清(human umbilical cord blood serum，CBS)代替胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)成功培養(yǎng)出hUCB－MSCs，不但培養(yǎng)周期短，且能保持hUCBMSCs良好的貼壁生長(zhǎng)能力及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。但因CBS的獲取數(shù)量畢竟有限，難以實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模的培養(yǎng)所需，因此，本文應(yīng)用部分CBS合用FBS培養(yǎng)hUCB－MSCs，觀察了hUCB－MSCs形態(tài)與表面標(biāo)志的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集 臍帶血標(biāo)本來(lái)源于遵義市婦幼保健院婦產(chǎn)科剖宮產(chǎn)胎兒，并經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬知情同意。產(chǎn)婦健康，排除HBV、HCV和HIV、梅毒感染者，臍血采集后4 h內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)流程。

1.1.2 CBS制備 采集臍帶血，4 ℃靜置2 h，吸取血清，2000 r/min離心10 min，留取上清，56℃水浴30 min，分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。取部分血清檢菌，無(wú)菌生長(zhǎng)者用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 Oricell Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Growth medium(OHUCMSC培養(yǎng)基，Cyagen公司)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco 公司)，F(xiàn)icoll分離液(天津?yàn)?、羊抗人波形蛋白單克隆抗體(Sigma公司)，間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定試劑盒A(BD Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 應(yīng)用Ficoll分離液從臍帶血中分離單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，離心后，吸取 MNCs，應(yīng)用Beckman coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，按5×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種。應(yīng)用10%FBS完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，37℃、5%的CO2飽和濕度下原代培養(yǎng)。7 d后半量換液，20～28 d逐漸形成較大的hUCB－MSCs集落，0.25%胰酶消化后，以 3%CBS+7%FBS(CBS組)或10%FBS(FBS組)的OHUCMSC培養(yǎng)基1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志的檢測(cè) 取第5代兩組細(xì)胞，參照試劑盒說(shuō)明于hUCB－MSCs懸液中加入 PE 標(biāo)記的 CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA－DR抗體和 CD44－PE、CD105－PerCPCyTM5.5、CD90－FITC、CD73－APC 抗體及其同型對(duì)照，孵育、洗滌、固定后，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cellqust軟件分析，測(cè)定hUCB－MSCs上述CD分子表達(dá)百分率。

1.2.3 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)取第5代兩組細(xì)胞爬片，滴加羊抗人波形蛋白抗體，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色、蘇木精復(fù)染檢測(cè)波形蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞及第5代細(xì)胞形態(tài)特征 原代培養(yǎng)MNCs，20～28d hUCB －MSCs呈集落生長(zhǎng)，集落周邊有一定數(shù)量的破骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)較大的集落的細(xì)胞融合80%后，傳代培養(yǎng)，至第3代，細(xì)胞呈旋渦狀、單一的梭型細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡下hUCB－MSCs生長(zhǎng)形態(tài)觀察

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 結(jié)果(見(jiàn)圖2)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，兩組hUCB－MSCs均高表達(dá)CD44、CD73、CD105和CD90，其中表達(dá)CD44和CD73細(xì)胞的百分率達(dá)99%以上，而兩組細(xì)胞均不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19 和 HLA －DR。

圖2 第5代hUCB－MSCs流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析圖(n=3)

2.3 波形蛋白表達(dá) 經(jīng)蘇木精復(fù)染后，兩組第5代hUCB－MSCs的胞漿內(nèi)可見(jiàn)較強(qiáng)棕色顆粒表達(dá)，即表達(dá)較高水平的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志波形蛋白，且均一性好，純度大于95%(見(jiàn)圖3)。

圖3 第5代hUCB－MSCs波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×200)

3 討論

目前，對(duì)于 hUCB－MSCs的培養(yǎng)，多采用全FBS，或者為了提高培養(yǎng)率而采用全CBS進(jìn)行培養(yǎng)。CBS可以有效地替代FBS培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞［4］，CBS中含多種促細(xì)胞增殖與保持干細(xì)胞特性的細(xì)胞因子，能更好地保持hUCB－MSCs的基本生物學(xué)特征，但因CBS存在采集量有限等問(wèn)題，為揚(yáng)長(zhǎng)避短，在探索不同比例單獨(dú)CBS、不同比例單獨(dú)FBS及不同比例CBS聯(lián)合FBS的基礎(chǔ)上，確定在本研究中采用3%CBS與7%FBS混合添加至OHUCMSC培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)hUCB－MSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CBS組與通常所用FBS組一樣，傳代培養(yǎng)至第5代的hUCB－MSCs均為典型的成纖維細(xì)胞樣，呈旋渦狀貼壁生長(zhǎng)，且細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。表明3%CBS與7%FBS的OHUCMSC培養(yǎng)基在5代以內(nèi)均能較好的保持hUCB－MSCs的形態(tài)特征。兩組第5代hUCB－MSCs也均一致地表達(dá) CD44、CD73、CD105 和 CD90，不表達(dá) CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA －DR，符合國(guó)際細(xì)胞治理協(xié)會(huì)規(guī)定的間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征［5］，也同以往的研究報(bào)道一致［6－7］，即 CBS與 FBS兩種血清聯(lián)合或單用 FBS，第5代內(nèi)均能良好的保持hUCB－MSCs表面標(biāo)志，尤其是CD44和CD73高達(dá)99%。CD44是介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間粘附的粘附分子［8］，CD73 即胞外 －5＇－ 核苷酸酶(ecto－5＇－nucleotidase)，是重要的免疫信號(hào)分子，也參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞粘附［9］，提示3%CBS與7%FBS合用培養(yǎng)hUCB－MSCs與10%FBS一樣保持了hUCB－MSCs的遷移、粘附與免疫調(diào)節(jié)功能。波形蛋白為一種中胚層來(lái)源間充質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)標(biāo)志蛋白［10］。兩組hUCB－MSCs胞漿均高表達(dá)波形蛋白，且表達(dá)波形蛋白細(xì)胞數(shù)量在95%以上，進(jìn)一步表明，3%CBS聯(lián)合7%FBS能很好地保持hUCB－MSCs的胞內(nèi)標(biāo)志蛋白，而沒(méi)有發(fā)生明顯的跨胚層改變。

本研究結(jié)果也提示，加入適量CBS，應(yīng)用兩種血清合用培養(yǎng)hUCB－MSCs，5代以內(nèi)不但能保持hUCB－MSCs的形態(tài)特征與表型標(biāo)志和胞內(nèi)標(biāo)志蛋白，可能對(duì)hUCB－MSCs的干性、分化能力及分泌等其他功能也無(wú)明顯影響，這需要進(jìn)一步確證。在更長(zhǎng)的hUCB－MSCs傳代培養(yǎng)中，CBS與FBS合用能否保持hUCB－MSCs的多種生物學(xué)特性，還有待進(jìn)一步研究，且CBS與FBS合用是否能更優(yōu)于單用FBS也值得深入。

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