艾 國 肖 芳 汪 鵬 嚴偉明 黃加權(quán) 寧 琴

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）的病因和發(fā)病機制迄今為止尚未得到完全闡明，遺傳易感、病毒感染、自身免疫異常等多種因素均可能參與其發(fā)病[1]。程序性死亡因子（programmed death-l，PD-1）是CD28家族中新發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)抑制信號的共刺激分子，主要功能是調(diào)節(jié)T細胞的活化及分化[2]。PD-1及其配體（programmed death–ligand 1，PD-L1）相互作用可對初次免疫應(yīng)答和記憶性或效應(yīng)性T淋巴細胞功能進行負性調(diào)控，從而抑制免疫反應(yīng)[3]。現(xiàn)有的研究表明，PD-1信號通路參與病毒性及微生物感染性疾病的進程[4，5]，在移植免疫[6]和腫瘤的免疫逃逸[7]中發(fā)揮著重要的作用。此外，PD-1的表達也與多種自身免疫性疾病如自身免疫性腦脊髓炎、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8～10]。然而，PD-1在AIH發(fā)病中的作用卻鮮有報道。本研究擬通過檢測AIH患者外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達情況，從疾病分期和性別的角度加以對比分析，以探討其在AIH發(fā)生發(fā)展中的意義，為AIH的免疫損傷及發(fā)病機制研究提供新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象 選取2012年9月至 2013年3月在我院就診的AIH患者22例，男6例，女16例，平均年齡41.4±1.5歲。其中7例在服用潑尼松龍治療后達到緩解，其余15例處于發(fā)病期未行免疫抑制劑治療。同時選取健康獻血者20例作為對照組，男8例，女12例，平均年齡29.0±0.5歲。病例診斷標準參考2008年國際免疫性肝炎小組（IAIHG）提出的AIH簡化診斷積分系統(tǒng)及2010年美國肝病學(xué)會（AASLD）更新的有關(guān) AIH的診斷和治療指南[11，12]。排除肝炎病毒感染及藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病等。

二、主要試劑 FITC標記的小鼠抗人CD3單克隆抗體、APC標記的小鼠抗人CD8單克隆抗體、PE標記的小鼠抗人PD-1單克隆抗體、小鼠IgG同型抗體和紅細胞裂解液均購自美國BD公司。

三、外周血淋巴細胞PD-1表達的檢測 采集外周靜脈血2ml，肝素抗凝，取100μL全血，分別加入小 鼠 抗 人 PD-l-PE、CD3-FITC和 CD8-APC各10μL，4℃避光孵育30min；加入2ml紅細胞裂解液避光靜置10min，加緩沖液洗滌3次后，取2%多聚甲醛300μL重懸細胞，立刻上機（BD FACS CantoTMⅡ型流式細胞儀）檢測，用Cell Quest軟件獲取標本中的細胞，以FSC和SSC設(shè)門讀取細胞，以CD3及CD8雙陽性圈定為CD8+T淋巴細胞，再測定外周血CD8+T淋巴細胞PD-1陽性比例。

四、統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，以GraphPad Prism 5.0作統(tǒng)計繪圖，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組計量資料比較用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、AIH患者及健康對照外周血CD8+T淋巴細胞PD-1總體表達情況 22例AIH患者的CD8+T淋巴細胞PD-1表達率為2.56±0.45%，明顯高于20例健康對照的0.46±0.06%，具有顯著性差異（P<0.001，圖1）。

圖1 兩組人群外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達的比較

二、不同疾病活動分期的AIH患者外周血CD8+T細胞PD-1表達的變化 在AIH發(fā)病期（15例），外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達頻率為2.6±0.7%，略低于緩解期（7例）的3.4±0.8%，但無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.5737）。

三、不同性別的AIH患者及健康對照外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達頻率的比較 12例女性健康對照人群外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達率為0.32±0.1%，略高于8例男性人群的0.23±0.1%，但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.6610）；16例女性AIH患者外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達率為3.5±0.7%，亦略高于6例男性患者的1.3±0.3%，但亦無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.1021）。

討論

PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的負性協(xié)同刺激分子，為免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，屬于CD28超家族成員。PD-1與細胞毒性T淋巴細胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）具有 23%的氨基酸同源性[2]，但其表達卻與CTLA-4不同，主要表達在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上[13]，說明PD-1比CTLA-4具有更廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。PD-1與其配體 PD-L1（B7-HI）或 PD-L2（B7-DC）結(jié)合后，通過其胞漿尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM基序）傳入抑制信號，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負性調(diào)控作用[3]。諸多實驗觀察了PD-1與其配體結(jié)合后對T細胞發(fā)生的作用，認為PD-1整體上發(fā)揮免疫抑制作用，可抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，對T細胞的增殖、細胞因子的分泌及殺傷能力都有抑制作用，阻斷該通路后可以恢復(fù)T細胞的大部分功能[14，15]。在慢性HBV、HCV和HIV感染患者外周血T細胞尤其是病毒特異性CD8+T細胞PD-1表達均上調(diào)，使其免疫功能受到抑制，病毒不能被有效清除而造成持續(xù)感染狀態(tài) 。

PD-1/PD-L通路抑制了免疫應(yīng)答的初始與效應(yīng)階段，維持機體的免疫自穩(wěn)，否則過強的免疫應(yīng)答將導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[8]。而PD-1缺陷小鼠則可以發(fā)生自身免疫性疾病[9，10]。另外，在許多自身免疫病動物模型如實驗性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性糖尿病等動物，阻斷PD-1/PD-L通路則加速疾病的嚴重程度及進展。對自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PD-1基因座的單核苷酸多態(tài)性的檢測也證實了這一點[18]。

本研究觀察了PD-l在AIH患者CD8+T細胞上的表達，結(jié)果顯示在AIH患者CD8+T細胞PD-1表達明顯高于正常對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。我們推測PD-l的高表達可能是應(yīng)對自身免疫反應(yīng)的代償，但增高的PD-1對于免疫反應(yīng)的下調(diào)作用尚不足以控制疾病的發(fā)生和進展。而疾病緩解期PD-1表達略高于發(fā)病期，雖然差異無顯著性，說明服用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素等可能通過增加PD-1的表達而發(fā)揮免疫抑制作用。PD-1/PD-L通路具有預(yù)防機體發(fā)生自身免疫或免疫亢進的作用，但PD-1/PD-L通路活化后結(jié)果與前端刺激信號的強弱、持續(xù)時間有關(guān)，抗原濃度與PD-1表達程度的相對關(guān)系可能與AIH等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。AIH患者淋巴細胞PD-1表達增高也可能是PD-1/PD-L通路在共刺激通路中的功能障礙或正性刺激過強超過了負性抑制作用，導(dǎo)致機體免疫耐受失衡，以致其對免疫反應(yīng)的抑制性調(diào)控作用不能顯現(xiàn)，繼而發(fā)生病變。對不同性別的健康對照和AIH患者CD8+T淋巴細胞PD-1表達分析可以發(fā)現(xiàn)，PD-1在女性表達略高于男性，差異無顯著意義，但為何女性更容易發(fā)生自身免疫肝炎則有待進一步研究。我們認為，PD-1在AIH患者體內(nèi)表達增強的研究具有重要意義，外周血PD-1的檢測可以作為明確患者存在自身免疫功能紊亂的參考指標。

本研究僅僅觀察了PD-1在AIH患者CD8+T細胞的表達，而PD-1在其它細胞亞群以及B淋巴細胞上如何表達和PD-L在抗原遞呈細胞的表達及其免疫調(diào)控作用仍需要進一步研究。包括PD-1在內(nèi)的負性與正性協(xié)同刺激信號構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對AIH的免疫調(diào)節(jié)機理及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍需要更深層次的研究，能否通過上調(diào)負性協(xié)同刺激信號、阻斷正性刺激信號而逆轉(zhuǎn)AIH的進展，仍需進一步探索。隨著分子靶向治療時代的到來，認識并把握AIH的免疫發(fā)病機制有助于推動治療AIH的抑炎與免疫調(diào)節(jié)新策略。

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