劉明強(qiáng) 莊少鵡 劉麗莎

原發(fā)性肝癌是指由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的腫瘤。作為人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國均較高，嚴(yán)重威脅著人民的健康和生命。我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，全世界每年新發(fā)肝癌約為25萬例，其中45%發(fā)生在中國，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，僅次于胃癌和食道癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有10萬人死于肝癌。目前，對于原發(fā)性肝癌，傳統(tǒng)的手術(shù)、介入和全身化療等療效欠佳，后者且具有很大的毒副作用。近年來，隨著對腫瘤分子水平認(rèn)識的不斷深入，阻斷腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路逐漸成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。本課題試圖通過抑制HepG2細(xì)胞熱休克蛋白90（Heat Shock Protein 90，HSP90）的分子伴侶功能，從而實(shí)現(xiàn)對肝癌細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的多點(diǎn)阻斷，以阻斷腫瘤賴以生存的信號通路網(wǎng)絡(luò)的功能發(fā)揮。

材料與方法

一、細(xì)胞與試劑 肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；格爾德霉素（Geldanamycin，GA，美國Alexis公司）；胎牛血清（中國杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）和 MTT（美國Sigma公司）；PBS（中國福州邁新試劑公司）；PI（美國Beckman公司）；Annexin V-FITC凋亡試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng) 取HepG2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天傳代1次，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

三、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTT法，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl。培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，更換含不同濃度（0.2、0.4和0.8μmol/L）GA的培養(yǎng)液200μl，分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h和72h。更換無血清培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加入MTT溶液（5mg/m1）20μl，37℃、5%CO2條件下孵育 4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10～15min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度OD值。另設(shè)對照組（加培養(yǎng)液及細(xì)胞，不含藥物）及空白組（只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞和藥物），每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）／（對照組OD值－空白組OD值）×100%

四、細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annexin V法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，24h后細(xì)胞貼壁，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使之同步化后棄培養(yǎng)液，更換含不同濃度（0、0.2、0.4和 0.8μmol/L）GA的培養(yǎng)液 200μl繼續(xù)培養(yǎng)48h。與對照組細(xì)胞（只加培養(yǎng)液）同時(shí)收集，按晶美公司的Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明進(jìn)行檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，多組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）、LSD-t或 SNK-q檢驗(yàn)。對多個(gè)樣本間非正態(tài)分布的資料（凋亡率）比較采用Kruskal-Wllis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GA對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用 經(jīng)不同濃度的GA干預(yù)后，HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制現(xiàn)象，且隨藥物干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的增加，GA對HepG2細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高，呈劑量－時(shí)間雙效應(yīng)關(guān)系（圖1）。

圖1 不同濃度GA對HepG2細(xì)胞增殖的影響

二、細(xì)胞凋亡的變化 在不同濃度的GA干預(yù)48h后，HepG2細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而漸增，且各組間細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（P＜0.05，表1和圖2、圖3）。

表1 不同濃度GA作用48h后HepG2細(xì)胞凋亡率（%，±s）的變化

表1 不同濃度GA作用48h后HepG2細(xì)胞凋亡率（%，±s）的變化

與對照組比，①P＜0.05

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圖2 對照組HepG2細(xì)胞凋亡

圖30.8μM GA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

討論

HSP90是一類廣泛存在于原核與真核細(xì)胞胞質(zhì)中的高度保守的同型二聚體分子伴侶，可參與多種蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象形成，在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和成熟過程中起重要作用。HSP90是一種ATP依賴的伴侶蛋白，并且具有ATP酶的活性。當(dāng)ATP與HSP90的N-末端ATP結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，HSP90構(gòu)象發(fā)生改變，兩個(gè)N末端發(fā)生短暫結(jié)合形成一個(gè)“關(guān)閉”（close）狀環(huán)形結(jié)構(gòu)，同時(shí)與HSP90結(jié)合的輔分子伴侶發(fā)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)換，此時(shí)，HSP90的受體蛋白處于穩(wěn)定的狀態(tài)，并能夠與配體結(jié)合或是能對刺激作出應(yīng)答。當(dāng)ATP水解成ADP后，HSP90的構(gòu)象再次發(fā)生改變，與其結(jié)合的輔分子伴侶再次發(fā)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)換，復(fù)合物中的受體蛋白被釋放出來，隨后經(jīng)過泛素化-蛋白酶體途徑降解[1～4]。

目前被發(fā)現(xiàn)的HSP90的受體蛋白已經(jīng)超過100種，其中大部分蛋白質(zhì)與細(xì)胞信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[5]。這些HSP90的受體蛋白主要包括：跨膜酪氨酸激酶（HER-2／neu、EGFR、MET、IGF1R）、亞穩(wěn)信號蛋白（Akt、Raf-1和 IKK）、成熟信號蛋白（p53、kit、Flt3、v-Src）、嵌合信號蛋白（NPM-ALK、Bcr-Abl）、甾體激素受體和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（cdk4和cdk6）等[6～9]。其中有一部分受體蛋白（如 Akt、Raf-1、HER-2/neu、CDK 4、CDK 6、Apaf-1、Nrf2等）與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞存活和與凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等有關(guān)[10，11]。因此，HSP90作為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一類高度保守的分子伴侶，可通過維持其受體蛋白的穩(wěn)定與活性而間接參與細(xì)胞內(nèi)多條重要的信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而多途徑多環(huán)節(jié)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程，其獨(dú)特的性質(zhì)使其成為抗腫瘤治療的良好分子靶點(diǎn)。

GA屬于苯醌安莎霉素類抗生素，起初GA的抗腫瘤效果被認(rèn)為是特異性抑制酪氨酸激酶，但研究揭示其抗腫瘤能力是依賴于致瘤性蛋白激酶在蛋白酶體中的降解。目前，通過免疫沉淀技術(shù)和X線結(jié)晶研究揭示證實(shí)，GA在體內(nèi)可與ATP競爭結(jié)合HSP90 N端的結(jié)合位點(diǎn)，從而改變HSP90構(gòu)象，使其不能與受體蛋白及輔分子伴侶形成復(fù)合體，抑制其行使正常的分子伴侶功能，最終導(dǎo)致受體蛋白降解。本研究利用GA抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)HSP90分子伴侶功能可能阻斷腫瘤細(xì)胞賴以生存的信號通路網(wǎng)絡(luò)，破壞腫瘤細(xì)胞的生長優(yōu)勢，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究顯示，HSP90功能抑制劑GA可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長增殖，抑制作用呈時(shí)效量效依賴關(guān)系。GA作用后HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，而且隨著藥物濃度的增高，GA對HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，證實(shí)了HSP90在肝癌HepG2細(xì)胞增殖及存活中起重要作用。

我們發(fā)現(xiàn)GA能劑量依賴性地抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能主要為GA通過抑制HSP90的分子伴侶功能，導(dǎo)致其受體蛋白的降解，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路的阻斷，從而最后影響到腫瘤細(xì)胞生長。當(dāng)然，細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控是細(xì)胞因子間相互作用和相互影響而形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，GA抑制人肝癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用，還可能通過多種細(xì)胞因子多種途徑來實(shí)現(xiàn)。相信在不久的將來，隨著研究的不斷深入和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷推陳出新，GA多種抑瘤作用的分子機(jī)制將逐漸被闡明，這將為GA臨床應(yīng)用治療肝癌及多種惡性腫瘤提供新的理論依據(jù)。

[1]Jiang Y，Bernard D，Yu Y，et al.Split renilla luciferase protein fragment-assisted complementation（SRL-PFAC）to characterize Hsp90-Cdc37 complex and identify critical residues in protein/protein interactions.J Biol Chem，2010，285（27）:21023-21036.

[2]Zhang T，Li Y，Yu Y，et al.Characterization of celastrol to inhibit hsp90 and cdc37 interaction.J Mol Biol，2009，284（51）:35381-35389.

[3]Produomou C，Pearl LH.Structure and functional relationships of Hsp90.Curr Cancer Drug Targets，2003，3（5）：301.

[4]Schulz R，Marchenko ND，Holembowski L，et al. Ⅰnhibiting the HSP90 chaperone destabilizes macrophage migration inhibitory factor and thereby inhibits breast tumor progression.J Exp Med，2012，209（2）:275-289.

[5]Moser C，Lang SA，Hackl C，et al.Targeting HSP90 by the novel inhibitor NVP-AUY922 reduces growth and angiogenesis of pancreatic cancer.Anticancer Res，2012，32（7）:2551-2561.

[6]Wang SA，Li HY，Hsu TⅠ，et al.Heat shock protein 90 stabilizes nucleolin to increase mRNA stability in mitosis.J Mol Biol，2011，286（51）:43816-43829.

[7]Sawai A，Chandarlapaty S，Greulich H，et al. Ⅰnhibition of Hsp90 down-regulates mutant epidermal growth factor receptor（EGFR）expression and sensitizes EGFR mutant tumors to paclitaxel.Cancer Res，2008，68（2）:589-596.

[8]Ⅰsaacs JS.Heat shock protein 90 as a molecular target for cancer therapeutics.Cancer Cell，2003，3：213.

[9]Niture SK，Jaiswal AK.Hsp90 Ⅰnteraction with ⅠNrf2（Keap1）mediates stress-induced Nrf2 activation.J Mol Biol，2010，285（47）：36865-36875.

[10]Holmes JL，Sharp SY，Hobbs S，et al.Silencing of HSP90 cochaperone AHA1 expression decreases client protein activation and increases cellular sensitivity to the HSP90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin.Cancer Res，2008，68（4）:1188-1197.

[11]Pedersen NM，Breen K，Rodland MS，et al.Expression of epidermal growth factor receptor or ErbB3 facilitates geldanamycin-induced down-regulation of ErbB2.Mol Cancer Res，2009，7（2）:275-284.