田 青 季 昀 龐學(xué)燕 王洪榮

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

在牛乳中，酪蛋白占總?cè)榈鞍椎?0%，它包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白(κ-casein，CSN3)(它們的比例為 4∶1∶4∶1)[1]。在功能方面，牛乳中酪蛋白首先起到營(yíng)養(yǎng)的作用，其次還有一個(gè)重要的功能就是穩(wěn)定蛋白質(zhì)，可以防止乳中蛋白質(zhì)凝集和沉淀[2]。CSN3作為4種常見的酪蛋白之一，是唯一一種含有糖分、對(duì)鈣不敏感的蛋白質(zhì)。研究表明，牛CSN3基因具有3種基因型，其中AA型和AB型出現(xiàn)的頻率較高，其中A等位基因在奶牛、肉牛或兼用型出現(xiàn)頻率平均為80%(高產(chǎn)奶牛為88.9%，肉牛為75%)，AB型在奶牛上的出現(xiàn)頻率較低(11.1%)，BB型在奶牛上的出現(xiàn)頻率僅為5.6%。因此，CSN3基因，尤其是A等位基因在牛乳形成過程中是否表達(dá)和表達(dá)量的高低決定著牛乳中蛋白質(zhì)含量的高低[3]。在大鼠上的研究表明，CSN3基因的表達(dá)對(duì)維持COP9信號(hào)小體(CSN)完整性、保證外胚層細(xì)胞存活、胚胎發(fā)育、維持乳腺細(xì)胞形態(tài)都是至關(guān)重要的，CSN3基因缺乏導(dǎo)致大鼠不哺乳幼鼠和喪失泌乳性能，因此是哺乳動(dòng)物泌乳和繁殖所必需的[4-5]。另外也有研究表明，CSN3基因與骨髓瘤、肝癌等腫瘤細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)，抑制CSN3基因表達(dá)可以引起生長(zhǎng)受阻并誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡[6-7]。由此可見，CSN3基因是一個(gè)至關(guān)重要的基因，研究胰島素(insulin，INS)對(duì)泌乳和乳蛋白合成的影響離不開此基因的作用。

前人研究表明，乳蛋白mRNA的合成和持續(xù)分泌是受泌乳激素調(diào)節(jié)的，其中泌乳素、糖皮質(zhì)激素和胰島素均起著主要作用[8]。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，它的存在能夠同時(shí)促進(jìn)乳蛋白和非乳蛋白的合成，并和催乳素具有協(xié)同效應(yīng)[9]。在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝方面，胰島素一方面促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝取和蛋白質(zhì)的合成，另一方面抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長(zhǎng)和生產(chǎn)。在體外研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的良好生長(zhǎng)需要一定胰島素水平的維持[10]。關(guān)于胰島素的作用機(jī)理，有研究表明，胰島素主要是通過促進(jìn)乳腺酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)牛乳中蛋白質(zhì)合成的，但對(duì)基因穩(wěn)定性沒有影響[11-12]，也有研究表明，胰島素促進(jìn)乳蛋白合成在Janus激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAKSTAT)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路中都有作用，而這2個(gè)信號(hào)通路都與胰島素亞基受體Ⅰ(IRS-Ⅰ)和胰島素受體(INSR)有密切關(guān)系，INSR是一個(gè)完整的細(xì)胞膜糖蛋白，它是胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合過程中必不可少的，INSR對(duì)血糖平衡的調(diào)節(jié)作用離不開胰島素的作用，如胰島素信號(hào)在成骨細(xì)胞、β細(xì)胞和肝細(xì)胞中發(fā)揮作用必須要有胰島素的分泌，以刪除白色脂肪組織中INSR，使葡萄糖代謝增強(qiáng)[13]。催乳素和胰島素的共同作用也離不開INSR[14]。在乳腺組織中胰島素主要是激活 IRS-Ⅰ，其次是激活I(lǐng)NSR后進(jìn)入信號(hào)通路，通過配體的約束力和自磷酸化的誘導(dǎo)促使INSR蛋白位點(diǎn)生成，維持血糖平衡，進(jìn)而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞泌乳[15-16]。由此可見，INSR基因是否表達(dá)和表達(dá)量的高低取決于是否有胰島素存在或胰島素的分泌量，而胰島素作用效果好壞又取決于INSR基因是否表達(dá)或表達(dá)量多少，因此要研究胰島素對(duì)乳蛋白合成基因CSN3的影響離不開對(duì)INSR基因的研究。本試驗(yàn)旨在以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為媒介，研究胰島素對(duì)CSN3和INSR基因表達(dá)的影響，為深入闡明胰島素的作用機(jī)理以及通過添加外源胰島素調(diào)控奶牛乳腺乳蛋白的合成和分泌，進(jìn)而提高牛乳中乳蛋白產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM/F12)、胎牛血清、催乳素、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、氫化可的松、胰島素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國(guó)Gibco公司。主要儀器有電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)、倒置顯微鏡(CKX41，日本Olympus)、超低溫冰箱(美國(guó) Thermo)、冷凍離心機(jī)(5415R型，德國(guó)Eppendorf)、常溫低速離心機(jī)(上海盧湘儀公司)、PCR儀(ABI 2720型，美國(guó)ABI)、NanoDrop ND-1000濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo)、實(shí)時(shí)定量 PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)儀(ABI 7500型，美國(guó)ABI)。

1.2 乳腺上皮細(xì)胞的獲取

在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場(chǎng)選擇健康的泌乳期奶牛，采用無菌操作方式進(jìn)行活體采樣，采用酶消化法[17-18]獲取乳腺上皮細(xì)胞，根據(jù)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受時(shí)間的不同及2種細(xì)胞貼壁速度的差異分離和純化乳腺上皮細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞中角蛋白-18進(jìn)行鑒定后，用RT-qPCR方法檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的CSN3和INSR基因的表達(dá)量。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞增殖測(cè)定

選用6代的細(xì)胞，復(fù)蘇后等密度(約2 000個(gè)/孔)接種于96孔板，采用單因素5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別用含有胰島素0(對(duì)照)、5、50、500和5 000 ng/mL的生長(zhǎng)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)細(xì)胞 0、2、4、6、8、10、12、22、24、36、48、60和72 h，于酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，周圍一圈孔中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)用以緩解蒸發(fā)，具體操作流程參照碧云天生物技術(shù)研究所的試劑盒[Cell Counting Kit-8(CCK-8)]說明書。

1.3.2 CSN3和INSR基因表達(dá)量測(cè)定

選用4代的細(xì)胞，復(fù)蘇后等密度接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70% ～80%時(shí)，先用無血清無激素含有雙抗和兩性霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基過渡16 h以上，采用單因素5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別用含有胰島素0(對(duì)照)、5、50、500 和 5 000 ng/mL 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

用生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞，用RNA提取試劑盒(RNAiso Plus，D9108A，日本TaKaRa)提取總 RNA，所有 RNA樣品在 NanoDrop ND-1000濃度測(cè)定儀上測(cè)定OD260nm/OD280nm，用以檢測(cè)總RNA濃度、純度和完整性。提取的總RNA保存于-70℃。

以提取的總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScripRT Master Mix，DRR036A，日 本TaKaRa)制備cDNA，采用80 μL總反應(yīng)體系。轉(zhuǎn)錄得到的RT-qPCR反應(yīng)液4℃保存。

以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列及參數(shù)見表1。

表1 引物序列及參數(shù)Table1 Secquences and parameters of primers

1.3.3 CSN3的相對(duì)含量測(cè)定

方法參照上海越研生物公司的牛CSN3 ELISA檢測(cè)試劑盒的說明書。

CSN3的相對(duì)含量=100×CSN3的含量(ng/L)/總蛋白的含量(mg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SAS 9.1中ANOVA進(jìn)行顯著性分析，Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

由表2可見，0～2 h，各組細(xì)胞增殖差異不顯著(P＞0.05)。在此之后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況逐漸發(fā)生變化，在4 h，5、50和500 ng/mL組乳腺上皮細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，5 000 ng/mL組與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)，但有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.098);6～24 h，5、50和500 ng/mL組細(xì)胞增長(zhǎng)都極顯著高于對(duì)照組和 5 000 ng/mL組(P＜0.01)，5 000 ng/mL組與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05);從22 h開始，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。36 h以后，各試驗(yàn)組之間細(xì)胞增殖情況差異不顯著(P ＞0.05)。

2.2 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3、INSR基因表達(dá)和CSN3相對(duì)含量的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，各基因進(jìn)行RT-qPCR時(shí)樣品測(cè)定重復(fù)性好，且在40個(gè)循環(huán)之前已到達(dá)平臺(tái)期，所以此反應(yīng)條件可行，測(cè)定數(shù)據(jù)可信。

由圖1可見，在培養(yǎng)液中添加胰島素能夠增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN3基因的表達(dá)，各試驗(yàn)組CSN3基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中50 ng/mL組極顯著高于 0、5和 500 ng/mL組(P＜0.01)，顯著高于 5 000 ng/mL組(P＜0.05)。從總體趨勢(shì)來看，胰島素對(duì)CSN3基因表達(dá)的促進(jìn)作用具有一定的劑量依賴關(guān)系，低劑量時(shí)隨著添加量的增加，CSN3基因的表達(dá)量也隨之增加，到達(dá)一定劑量后，隨著胰島素添加量的增加，CSN3基因的表達(dá)量反而下降，說明高劑量的胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白的合成不利。

由圖2可見，胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞INSR基因表達(dá)的影響有著與CSN3基因有相同的趨勢(shì)，即:低劑量時(shí)，隨著添加劑量的增加，INSR基因的表達(dá)量也增加，超過50 ng/mL后，再隨著劑量的增加，INSR基因的表達(dá)量反而下降，尤其是高劑量(5 000 ng/mL)的添加量使得INSR基因的表達(dá)量極顯著地低于5和50 ng/mL組(P＜0.01)，顯著低于對(duì)照組與500 ng/mL組(P＜0.05)。這也進(jìn)一步證實(shí)了，胰島素添加劑量過大對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白造成了不利影響。

表2 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響Table2 Effects of INS on proliferation of bovine mammary epithelial cells

圖1 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of INS on the expression of CSN3 gene in bovine mammary epithelial cells

CSN3含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.000 6X-0.171 3(R2=0.973 4，圖3)。由圖4可見，胰島素能顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3的相對(duì)含量，各試驗(yàn)組均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。各試驗(yàn)組之間，50 ng/mL組效果最好，其CSN3的相對(duì)含量極顯著地高于5和500ng/mL組(P＜0.01)，顯著高于5 000 ng/mL組(P＜0.05)。

圖2 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞INSR基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of INS on the expression of INSR gene in bovine mammary epithelial cells

2.3 胰島素濃度與奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3和INSR基因表達(dá)量以及CSN3相對(duì)含量的相關(guān)性分析

由表3可知，胰島素濃度≤50 ng/mL時(shí)，CSN3基因表達(dá)量與胰島素濃度間無顯著相關(guān)(P＜0.05);INSR基因表達(dá)量與胰島素濃度間(P＞0.05);CSN3相對(duì)含量與胰島素濃度間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。胰島素濃度≥50 ng/mL時(shí)，CSN3基因表達(dá)量與胰島素濃度間無顯著相關(guān)(P＞0.05);INSR基因表達(dá)量與胰島素濃度間有呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)(P=0.054);CSN3相對(duì)含量與胰島素濃度間無顯著相關(guān)(P＞0.05)。胰島素濃度在0～5 000 ng/mL時(shí)，INSR基因表達(dá)量與胰島素濃度間呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05);CSN3基因表達(dá)量、CSN3相對(duì)含量與胰島素濃度間均無顯著相關(guān)(P＞0.05)。

圖3 CSN3含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of CSN3 content

圖4 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3相對(duì)含量的影響Fig.4 Effects of INS on the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

2.4 胰島素濃度與奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3和INSR基因表達(dá)量以及CSN3相對(duì)含量的的回歸分析

以胰島素的不同濃度0、5、50、500 和5 000 ng/mL為自變量(X)，分別與CSN3、INSR基因表達(dá)量和CSN3相對(duì)含量(因變量，Y)之間進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明CSN3、INSR的基因表達(dá)量和CSN3相對(duì)含量與胰島素濃度間呈二次方曲線關(guān)系。方程(圖5)如下，CSN3基因表達(dá)量:Y=0.122 4X2+0.812 5X+0.260 1(R2=0.282 4)，回歸關(guān)系不顯著(P=0.718);INSR基因表達(dá)量:Y=0.12X2+0.645 6X+0.479 7(R2=0.996 0)，回歸關(guān)系極顯著(P＜0.01);CSN3相對(duì)含量:Y=-24.062X2+159.62X-101.05(R2=0.409 2)，回歸關(guān)系不顯著(P=0.771)。

3 討論

影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳的合成和品質(zhì)，尤其是乳蛋白合成的因素很多，如遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境與管理、激素與生長(zhǎng)因子等，其中影響乳蛋白合成的主要激素有胰島素、糖皮質(zhì)激素、催乳素、孕激素、生長(zhǎng)激素等，近年來對(duì)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成因素的研究主要集中在對(duì)細(xì)胞中酪蛋白和乳清蛋白的檢測(cè)上[20-21]，而其調(diào)控機(jī)理也集中在3個(gè)方面:一是血流量，研究發(fā)現(xiàn)血流量為激素對(duì)乳腺乳蛋白合成的主要調(diào)控點(diǎn)，胰島素能夠增加乳腺對(duì)氨基酸和葡糖糖的攝取率，增加血流，進(jìn)而增加乳蛋白的含量[22]。二是細(xì)胞信號(hào)通路，其中mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[23]。mTOR是細(xì)胞內(nèi)多種重要信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控蛋白，調(diào)控著細(xì)胞翻譯起始、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成及降解功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和凋亡等細(xì)胞重要環(huán)節(jié)[24]。激素作為生長(zhǎng)因子之一主要是通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路實(shí)現(xiàn)的[25-26]。另外，胰島素在JAK-STAT信號(hào)通路中主要是激活I(lǐng)RS-Ⅰ，通過配體的約束力和自磷酸化的誘導(dǎo)，促使INSR蛋白位點(diǎn)的生成，從而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞乳的生物合成[27]，但是似乎不管哪條信號(hào)通路發(fā)揮作用都離不開激素受體。三是通過激素來調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫來調(diào)節(jié)泌乳和乳蛋白的合成[28-35]，這方面的作用就目前的研究來看主要集中在催乳素、生長(zhǎng)激素和一些調(diào)節(jié)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)等上面，如生長(zhǎng)激素可以通過營(yíng)養(yǎng)重分配和維持奶牛乳腺細(xì)胞功能來促進(jìn)奶牛乳腺β-酪蛋白基因表達(dá)[36]，糖皮質(zhì)激素和催乳素可以誘導(dǎo)β-酪蛋白基因表達(dá)，乳腺組織相關(guān)生長(zhǎng)因子活性功能的發(fā)揮也需要催乳素的存在[37]，催乳素缺乏造成產(chǎn)奶量下降，但外源添加催乳素和生長(zhǎng)激素則可以提高產(chǎn)奶量[38]，下調(diào)INSR可以抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[39]等。近年來關(guān)于胰島素在這方面的作用，尤其是關(guān)于作用機(jī)理的研究目前尚未不多見，關(guān)于胰島素的研究似乎還停留在早期的體內(nèi)研究，如奶牛體內(nèi)低的胰島素濃度有增加奶牛間情期發(fā)病的危險(xiǎn)，粒層細(xì)胞上胰島素及其受體濃度的改變會(huì)影響卵泡生長(zhǎng)和類固醇的生成[40]，因此推測(cè)奶牛乳腺組織中胰島素及其受體的改變也會(huì)影響乳腺生長(zhǎng)和乳蛋白的合成且作用也與其他泌乳激素具有相同的作用機(jī)制。因此本試驗(yàn)主要以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為載體，通過不同劑量外源胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、CSN3和INSR基因表達(dá)量影響分析，旨在了解胰島素本身對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成相關(guān)基因的影響，為進(jìn)一步而闡明胰島素的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

表3 胰島素濃度與奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3和INSR基因表達(dá)量以及CSN3相對(duì)含量的相關(guān)系數(shù)Table3 Correlative coefficient among INS concentration，expressions of CSN3 and INSR genes and the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

圖5 胰島素濃度與奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3和INSR基因表達(dá)量以及CSN3相對(duì)含量的回歸分析Fig.5 Regression analysis among INS concentration，expressions of CSN3 and INSR genes and the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

3.1 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

胰島素在體外能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，在體內(nèi)也是一種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞水平上它主要是通過與細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，濃度較高時(shí)也能夠被IGF-Ⅰ受體激活，胰島素能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖又能通過INSR的作用抑制白血病細(xì)胞增殖[41]。Andrea 等[42]用不同濃度胰島素(10～10 000 ng/mL)作用于 HL-60、U937、ML-1細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示，10 ng/mL的胰島素可促進(jìn)細(xì)胞增殖，隨著濃度增高，促增殖作用增強(qiáng)，各細(xì)胞系的最佳促進(jìn)濃度不一，進(jìn)一步加大濃度(＞1 000 ng/mL)，促增殖作用逐漸減弱。陳彥如等[43]研究發(fā)現(xiàn)胰島素對(duì)Reh細(xì)胞具有濃度和時(shí)間依賴性的促增殖作用，當(dāng)胰島素濃度為1×10-9mol/L時(shí)其促增殖作用最強(qiáng)，與對(duì)照組相比，胰島素有明顯的促增殖作用。王耀輝等[44]以大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)為模型，研究了不同濃度胰島素對(duì)VEC增殖過程中INSR和FK506結(jié)合蛋白12(FKBP12)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)超過大鼠生理水平的胰島素使INSR和FKBP12基因的表達(dá)量低于對(duì)照，說明高濃度的胰島素可使VEC對(duì)生理濃度胰島素的反應(yīng)性降低，該胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)至少維持24 h。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，隨著胰島素濃度的增加，胰島素促細(xì)胞生長(zhǎng)作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)超過50 ng/mL時(shí)促增殖作用逐漸減弱，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)促生長(zhǎng)作用逐漸增強(qiáng)，到了22 h以后進(jìn)入平臺(tái)區(qū)，趨于穩(wěn)定，超過48 h以后促增殖作用逐漸減弱，這與以上研究結(jié)果基本一致，其原因一方面是胰島素的濃度過大造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞胰島素反應(yīng)性降低，INSR基因表達(dá)量減少，進(jìn)而使胰島素作用減弱;另一方面隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分逐漸耗盡，細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到了一定的限制，進(jìn)而生長(zhǎng)減緩甚至停止生長(zhǎng)。

3.2 胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3、INSR基因表達(dá)和CSN3相對(duì)含量的影響

在體內(nèi)，Molento等[40]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射胰島素能夠提高乳蛋白和酪蛋白的含量，降低乳中尿素氮的含量，Comin等[45]研究發(fā)現(xiàn)，CSN3和 β-酪蛋白基因?qū)Ξa(chǎn)奶量、牛乳凝固特性和乳蛋白產(chǎn)量影響很大，而對(duì)乳中脂肪、蛋白質(zhì)比例和其他質(zhì)量特性影響不大，似乎CSN3基因?qū)εＨ榉€(wěn)定性方面的作用更顯著一些，但在山羊研究發(fā)現(xiàn)BB型和AB型比AA型CSN3基因與總酪蛋白和乳蛋白的含量具有更高的相關(guān)性[46]。Léonard 等[47]給荷斯坦奶牛體內(nèi)每小時(shí)灌注2.5 IU胰島素+50 g葡萄糖發(fā)現(xiàn)，奶?；铙w日增重增加了0.65 kg，乳蛋白產(chǎn)量比生理鹽水灌注組和葡萄糖灌注組分別增加了11%和14%。乳腺靜脈注射胰島素(每小時(shí)1.0 μg/kg BW)和胰島素+支鏈氨基酸均顯著增加了乳中酪蛋白含量，分別增加了15%和 25%[48]。

在體外，陳建暉等[10]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞系為基礎(chǔ)研究了胰島素、催乳素及孕酮對(duì)乳腺上皮細(xì)胞泌乳機(jī)能的影響，結(jié)果表明，在培養(yǎng)液中添加胰島素后72 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中酪蛋白含量升高不明顯而培養(yǎng)液中酪蛋白的分泌明顯升高。佟慧麗等[49]用添加有胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與胰島素組細(xì)胞總蛋白分泌水平差異不大。研究表明，胰島素可以協(xié)同氫化可的松和催乳素促進(jìn)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和乳蛋白的合成，胰島素單獨(dú)存在對(duì)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)也起著很關(guān)鍵的作用[50-51]。

本試驗(yàn)在添加胰島素后進(jìn)行了為期24 h的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，各組CSN3基因的表達(dá)量均高于對(duì)照，其中添加胰島素50 ng/mL組極顯著高于0、5和500 ng/mL組，顯著高于5 000 ng/mL組，這與陳建暉等[10]的研究結(jié)果不太一致，這可能是由于在他們的試驗(yàn)中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中酪蛋白分泌到了培養(yǎng)液中造成的。而在佟慧麗等[49]的試驗(yàn)中，由于沒設(shè)對(duì)照組(對(duì)照組細(xì)胞不能貼壁)，所以各組間總蛋白分泌水平差異不大，本試驗(yàn)則是先用完全培養(yǎng)基促使細(xì)胞貼壁后，經(jīng)過16 h以上的過渡，采用含有不同濃度胰島素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的，所以與對(duì)照組相比有差異。從CSN3的相對(duì)含量來看，胰島素能顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN3的相對(duì)含量，各試驗(yàn)組均極顯著高于對(duì)照組。各試驗(yàn)組之間，50 ng/mL的添加劑量效果最好，其 CSN3的相對(duì)含量極顯著地高于5和500 ng/mL組，顯著高于5 000 ng/mL組，這與前人研究結(jié)果基本一致，說明添加胰島素能夠顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN3的合成并促進(jìn)其分泌。

Kong等[52]2008年研究確定 INSR是天然產(chǎn)物黃連素增加胰島素活性的靶點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的人得肝細(xì)胞中，在有胰島素存在時(shí)，黃連素能增加INSR基因表達(dá)量和蛋白合成量，當(dāng)INSR基因被沉默時(shí)，這種效應(yīng)減弱，說明胰島素要發(fā)揮作用離不開INSR。INSR能夠反映人生理胰島素濃度[53]。胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞INSR基因表達(dá)的影響趨勢(shì)基本與對(duì)CSN3基因表達(dá)的影響相同，即低劑量時(shí)，隨著胰島素添加劑量的增加，IN-SR基因的表達(dá)量也增加，超過50 ng/mL添加量后，再隨著劑量的增加，INSR基因的表達(dá)量反而下降，尤其是高劑量(5 000 ng/mL)的添加量使得INSR基因的表達(dá)量極顯著地低于其他各試驗(yàn)組。從本試驗(yàn)結(jié)果的總體趨勢(shì)來看，胰島素對(duì)CSN3和INSR基因表達(dá)的促進(jìn)作用具有一定的劑量依賴關(guān)系，低劑量時(shí)隨著添加量的增加，CSN3和INSR基因的表達(dá)量也隨之增加，到達(dá)一定劑量后，在隨著胰島素添加量的增加，CSN3和INSR基因的表達(dá)量反而下降，說明高劑量的胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白的合成不利，這與胡小麗等[54]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞Fc受體(FcRn)基因上的研究結(jié)果一致，也與之前的推測(cè)相吻合，說明胰島素的確可以通過改變INSR濃度進(jìn)而影響乳蛋白合成?？赡艿脑蚴歉邉┝康囊葝u素抑制了其受體基因的表達(dá)，進(jìn)而阻止了PI3K-mTOR和JAK-STAT信號(hào)通路，使乳蛋白的合成受到了抑制，這個(gè)原因還需要進(jìn)一步測(cè)定2個(gè)信號(hào)通路中的相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)一步確定。通過本試驗(yàn)的相關(guān)分析和回歸分析可見，當(dāng)培養(yǎng)液中胰島素濃度≤50 ng/mL時(shí)，胰島素濃度與CSN3和INSR基因的表達(dá)量均呈正相關(guān)，胰島素濃度≥50 ng/mL時(shí)，胰島素濃度與CSN3和INSR基因的表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān);在0～5 000 ng/mL之間，INSR基因表達(dá)量與胰島素濃度間呈顯著負(fù)相關(guān)，而CSN3基因表達(dá)量與胰島素濃度間呈正相關(guān)，CSN3相對(duì)含量與CSN3基因表達(dá)量一致。這不但證實(shí)了高劑量的胰島素能夠抑制其受體基因的表達(dá)，添加胰島素能夠促進(jìn)CSN3基因的表達(dá)和CSN3的合成，而且也提出了新問題，即:雖然胰島素能夠促進(jìn)CSN3基因的表達(dá)和CSN3的合成，但是CSN3基因的表達(dá)和CSN3的合成卻并不和INSR基因表達(dá)趨勢(shì)一樣呈顯著的二次方的曲線回歸關(guān)系，這暗示胰島素對(duì)CSN3基因表達(dá)的影響并不完全是通過INSR這一條通路完成的，其機(jī)制(尤其是胞外)還有待進(jìn)一步研究。另外，在以后的研究中，應(yīng)該更加深入的從CSN3基因的不同基因型著手，綜合考慮牛乳穩(wěn)定性等因素，得到更加準(zhǔn)確和貼近生產(chǎn)實(shí)際的結(jié)果來指導(dǎo)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

隨著胰島素濃度的增加，CSN3和INSR基因的表達(dá)量及CSN3相對(duì)含量均呈先增加后下降的趨勢(shì)，50 ng/mL時(shí)最高，而高濃度(5 000 ng/mL)的胰島素不利于奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白。

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