王美琴 趙 峰 賈 剛 劉成玲 王鈺明 張宏福

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

排空強飼法已被我國采用并作為評定雞飼料代謝能值的國家標準方法(GB/T 26437—2010)［1］。但是其測試過程繁瑣，在單一飼料原料的重復測定中，直接法的最大相對偏差為0.7%～4.6%［2］，套算法則高達 58.5%［3］。由此可見，使用國家標準方法對飼糧間代謝能值的差異進行識別時，尚需要對該方法的靈敏性及置信限等進行進一步分析，以規(guī)范其適用范圍。目前，在排空強飼法測定雞飼糧代謝能值的可靠性上，研究工作主要集中在方法的實驗室間再現(xiàn)性變異系數(shù)［4-5］，重復批次間的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)［6］，代謝能值測定的變異因素來源等［6-7］方面。而在排空強飼法的靈敏度上，即樣品的代謝能值變化后，排空強飼法所檢測到的代謝能值有多大變化?能被排空強飼法所區(qū)分的飼糧間表觀代謝能(AME)有顯著差異的最小值，即樣品間AME差異的置信限是多少?這些基礎(chǔ)參數(shù)仍鮮見相關(guān)研究報道。為了檢驗排空強飼法測定雞飼糧AME值的靈敏度及樣品間差異的置信限，首先需要建立飼糧AME梯度并確定稀釋劑與飼糧養(yǎng)分間的互作效應是否可以忽略不計，在此基礎(chǔ)上，檢驗飼糧AME變化后排空強飼法測定AME值的響應量，以檢測其靈敏性。然后，根據(jù)空白測試、飼糧AME值測定的方差，按照統(tǒng)計學原理估測排空強飼法測定樣品間AME值差異的置信限。綜合以上2個方面的結(jié)果，旨在為排空強飼法測定雞飼糧AME值的靈敏度與置信限提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗動物管理

本研究分為2個試驗，其中試驗1旨在考察飼糧中添加一定比例的稀釋劑(花生殼)后能否建立相應梯度的AME值，以及排空強飼法能檢測到的AME值顯著反應量的大小。采用2×5兩因素完全隨機設(shè)計，其中基礎(chǔ)飼糧設(shè)2個水平，即AME與粗蛋白質(zhì)水平與NRC(1994)推薦最低需要量相等的飼糧1，AME與粗蛋白質(zhì)水平比 NRC(1994)推薦最低需要量高10%的飼糧2。稀釋劑設(shè)5個水平，即在基礎(chǔ)飼糧中分別添加2%、4%、6%、8%和10%的花生殼，形成不同AME梯度的10個飼糧。AME測定中選取體重2.0 kg、無怪癖的健康成年海蘭褐殼蛋公雞96只，隨機分成4組，每組6個重復，每個重復4只雞，單籠飼養(yǎng)于代謝籠中，分批次測定試驗飼糧的AME值。

試驗2通過分析空白樣品、靈敏度測試中飼糧AME值的方差是否相等，確定排空強飼法中飼糧AME值標準差的平均值，根據(jù)兩樣本統(tǒng)計顯著性原理，計算2個樣品間AME值的差異顯著時對應的置信限?？瞻讟悠窚y試數(shù)據(jù)為:考察絕食條件下，即空白樣品條件下，假定強飼50 g(風干物質(zhì))完全不消化的飼糧樣品為空白樣品，測定空白樣品的AME值。選取體重2.0 kg、無怪癖的健康成年海蘭褐殼蛋公雞96只，隨機分成4組，每組8個重復，每個重復3只雞，單籠飼養(yǎng)于代謝籠中，分4個批次重復測定內(nèi)源能的排泄量。靈敏度測試數(shù)據(jù)為試驗1中的代謝試驗數(shù)據(jù)。

所有試驗動物均自由采食，通過乳頭飲水器自由飲水，每日光照12 h，代謝室的溫度維持在25℃。日常管理按照動物營養(yǎng)學國家重點實驗室的常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進行。代謝試驗期間按GB/T 26437—2010進行管理。

1.2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平

試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 代謝試驗過程

代謝試驗過程參照GB/T 26437—2010，具體操作程序:代謝試驗預試期3 d，最后1次飼喂試驗飼糧;排空48 h后強飼試驗飼糧50 g(精確到0.000 2 g)，并準確記錄每只試驗雞的強飼結(jié)束時間;排泄物收集48 h后，試驗雞進入10 d以上的恢復期，恢復期及預試期前2天飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(表1)，并自由飲水。排泄物的制備與分析:排泄物收集完成后，立即將其置于65℃的烘箱中烘干至恒重，回潮24 h后將每個重復內(nèi)雞的風干排泄物總量稱重記錄，并粉碎過40目篩，立即取部分樣品按照GB/T 6435—1986測定其干物質(zhì)(DM)含量，并計算雞的DM排泄量。其余樣品封裝后置于-20℃冰箱保存待進一步分析;總能的測定根據(jù)ISO 9831∶1998的規(guī)定進行，并同步測定排泄物的DM含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

被測飼糧AME的計算:

式中:GE1為攝入總能(J);M1為攝入DM量(g);GE2為排泄物總能(J);AME為被測飼糧AME(MJ/kg DM)。

以SAS 9.0的MEANS模塊對數(shù)據(jù)進行分析，采用ANOVA模塊對方差的齊次性進行Levene’s檢驗。GLM模塊對飼糧中稀釋劑水平與AME的線性關(guān)系、二次方關(guān)系及線性失擬進行檢驗。采用REG模塊對飼糧AME實測值與計算值的線性關(guān)系進行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 以花生殼為稀釋劑建立飼糧AME梯度的檢驗

在NRC(1994)推薦的最低AME與蛋白質(zhì)水平飼糧(飼糧1)與高AME高蛋白質(zhì)水平飼糧(飼糧2)條件下，隨著花生殼(稀釋劑)水平以2%的梯度增加，飼糧的AME值依次降低。由表2可知，飼糧來源(飼糧1、2)和稀釋劑的水平對稀釋后飼糧的AME值均有顯著影響(P＜0.01)，但兩者對稀釋后飼糧的AME值無顯著交互效應(P=0.056 9)。由此可見，2種飼糧在AME值上的顯著差異與本試驗設(shè)計中飼糧1與飼糧2在AME與蛋白質(zhì)水平上相差10%相對應，并且在稀釋劑添加水平相同的情況下，稀釋后的2種飼糧仍呈現(xiàn)差異。在稀釋劑水平與飼糧AME值的關(guān)系上，假設(shè)稀釋劑(花生殼)的AME值為0，則對10個稀釋后飼糧AME計算值(AMEc，根據(jù)飼糧1、2 AME的實測值乘以稀釋后飼糧中飼糧1、2的含量)與排空強飼法AME實測值分別作T檢驗，兩者的差異均不顯著(P＞0.05)，這表明花生殼可以視為AME值為0的純稀釋劑，也進一步說明，花生殼對稀釋后2種飼糧的AME值的影響是相似的(即無互作效應)。2種飼糧條件下，稀釋劑的水平(2% ～10%)對稀釋后飼糧的AME值呈顯著的線性關(guān)系(P＜0.01)，而二次函數(shù)關(guān)系與線性失擬檢驗均不顯著(P＞0.05)。綜合上述分析，通過增加稀釋劑的水平可以線性地建立不同AME梯度的飼糧。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

2.2 排空強飼法測定飼糧AME值的響應量

在以花生殼為稀釋劑建立飼糧AME值的梯度中，已得出稀釋劑的水平與飼糧來源對稀釋后飼糧的AME值無互作效應，且花生殼是AME值為0的稀釋劑。因此，在檢測排空強飼法對飼糧AME值的響應量上，可以將10個飼糧視為屬于同一個系統(tǒng)。根據(jù)前述統(tǒng)計分析，在確定稀釋后飼糧AME的理論值上，通過排空強飼法(國家標準方法)測定飼糧1、2的AME值，然后按照稀釋后飼糧中稀釋劑的比例依次計算得出相應的AMEc。根據(jù)化學分析中靈敏度的含義，引申AME值測定的靈敏度為被測飼糧AME改變1個單位AMEc的變化值(dAMEc)時所引起的排空強飼法檢測到的AME的變化值(dAME)，即 m=dAME/dAMEc。以AMEc為依變量，以排空強飼法AME實測值為應變量作線性回歸分析(圖1)，得出dAME/dAMEc=0.987(P＜0.01)，這表明，排空強飼法檢測到的AME值對飼糧AME值的變化具有較高的靈敏度。

表2 稀釋劑的水平對飼糧AME值的影響Table 2 Effects of the level of diluent on dietary AME value MJ/kg DM

2.3 排空強飼法測定飼糧樣品間AME值差異的置信限

在AME值測定中，由于難以規(guī)范完全不消化的空白樣品實物，因此，空白樣品AME為假設(shè)強飼50 g完全不消化的飼糧樣品(本試驗中飼糧DM含量為93.3%)所測得的 AME值，AME=(FEI-FEO-EEL)/(50×0.933)(式中，F(xiàn)EI為50 g空白飼糧的能量攝入量;FEO為空白飼糧來源的糞尿能排泄量;EEL為內(nèi)源能排泄量)。由于空白飼糧是完全不消化的，因此FEI=FE o，空白飼糧AME=-EEL/(50×0.933)。根據(jù)該公式，采用絕食法收集內(nèi)源排泄物可以測定空白飼糧的AME值。本研究中(表3)，通過4個批次，測定每只成年公雞的內(nèi)源能排泄量為57.29～70.56 kJ，批次間內(nèi)源能排泄量差異不顯著(P＞0.05)。相應地，4個批次中，空白飼糧的AME值為-1.51～-1.23 MJ/kg DM，平均值為-1.38 MJ/kg DM。

圖1 飼糧AME實測值對AMEc的響應量Fig.1 The response of determined AME value to AMEc

在空白樣品(內(nèi)源能排泄量)測定中，4個批次中樣品 AME的標準差在 0.16～0.38 MJ/kg DM，平均值為0.26 MJ/kg DM，批次間AME方差的差異不顯著(P=0.279 7)，這表明試驗雞內(nèi)源能排泄量的變異是穩(wěn)定的。在10個飼糧的測定中，AME的標準差在0.11～0.24 MJ/kg DM，平均值為0.19 MJ/kg DM，飼糧AME間方差的差異不顯著(P=0.873 7)，這表明，排空強飼法測定飼糧AME的變異是穩(wěn)定的。通過對空白樣品與飼糧測定中AME的方差進行比較，得出兩者的差異也不顯著(P=0.400 7)。由于排空強飼法中，飼糧的攝入量變異很小，所以飼糧AME值測定的變異主要來源于排泄物質(zhì)量的變異［6］。由此可以得出雞內(nèi)源能排泄量的變異與飼糧測定中糞尿能總排泄量的變異是接近的。

表3 絕食法測定空白樣品的AME值Table 3 The AME value of blank sample using fasting method

根據(jù)統(tǒng)計分析中2個樣本差異比較的顯著性檢驗原理［9］，當2個樣品AME的差值大于集合標準誤的2.228倍時(df=10，α=0.05)，表明樣品的AME存在顯著性差異。因此，可以將該統(tǒng)計量作為排空強飼法測試飼糧樣品間AME差異的置信限。本試驗中，14次AME測定的方差無統(tǒng)計顯著性差異(P＞0.05)，因此，將其平均值作為普通樣本的方差估計值，則2個樣本間的集合標準誤為 0 .21=0.12 MJ/kg DM，置信限為2.228×0.12=0.27 MJ/kg DM。

3 討論

3.1 排空強飼法測定飼糧AME值的靈敏度

從方法學的角度看，方法的可靠性需要從準確度、精度、線性(靈敏度)、置信限等方面進行綜合評估［10］。目前，在生物學法測定家禽飼糧代謝能值的重復性(精度)上已開展了許多研究工作［2，4-6］，而在方法的線性靈敏度上，以往的研究主要集中在幾種飼料原料間代謝能值的可加性研究［11-14］上?；驹硎峭ㄟ^單樣本T檢驗，比較2種或多種原料混合后飼糧的代謝能實測值與根據(jù)單一原料代謝能實測值及飼糧中原料組成比例計算出的代謝能值，得出方法是否具有可加性。然而，對幾個飼糧進行可加性檢驗難以確定生物學法在多大范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性可加性，以及對飼糧的代謝能值發(fā)生變化后所測試到的代謝能值的反應量也難以定量，因此，生物學法的可加性檢驗并不能說明方法的靈敏度。本研究中，在2種飼糧中加入2% ～10%的花生殼，使10個飼糧的AME值在12.14～14.13 MJ/kg DM的范圍內(nèi)呈梯度變化，通過排空強飼法檢測到飼糧的AME值在12.01～13.91 MJ/kg DM相應變化，AME實測值對計算值的比例為0.987。這表明當飼糧AME在2%的梯度以上變化時，排空強飼法能靈敏地反映 其變化。

表4 空白樣品和飼糧AME測定的方差齊次性檢驗Table 4 Homogeneitytest of AME variance of blank sample and diets MJ/kg DM

3.2 排空強飼法測定飼糧樣品間AME值差異的置信限

在對2個或2個以上飼料原料或飼糧樣品的代謝能值進行比較時，通常采用生物統(tǒng)計的兩樣本T檢驗或方差分析的多重比較得出結(jié)論。但目前仍鮮見排空強飼法可準確分辨飼料原料或飼糧間AME有顯著差異的最小值，即樣品間AME值差異的置信限。本試驗通過對4次絕食代謝內(nèi)源能排泄量及10個飼糧AME值的方差比較，得出了飼糧間AME值的方差、內(nèi)源能排泄量的方差均無顯著性差異。這表明排空強飼法測定飼糧AME值時，測試結(jié)果的變異是穩(wěn)定的。由此得出，對飼糧而言，排空強飼法能區(qū)分樣品間AME值存在顯著差異時所需要的最低差值為0.27 MJ/kg DM，即為飼糧AME值的2.1%。而將Sibbald［11］對10個雞飼糧的真代謝能(TME)值測定的標準差進行與本試驗相同的分析后，得出排空強飼法測定飼糧樣品間 TME值差異的置信限為0.28 MJ/kg DM。由此可見，將0.27 MJ/kg DM作為排空強飼法測定飼糧間AME值差異的置信限是合適的。而對單一原料而言，直接法可測定的原料如谷實類飼料，因其營養(yǎng)物質(zhì)組成不如飼糧平衡，排空強飼法測定AME值的方差可能比飼糧高，相應地，區(qū)分飼料間AME值顯著差異的置信限比0.27 MJ/kg DM大一些。對套算法測定的飼料原料而言，因假設(shè)基礎(chǔ)飼糧的AME值是穩(wěn)定的，待測飼料在試驗飼糧中占的比例在20%以上［15］，相應地，區(qū)分飼料間AME值顯著差異的置信限最高可達0.27/0.2=1.35 MJ/kg DM。因此，對排空強飼法測定單一飼料原料的樣品間AME值差異的置信限還需要進一步確定。

4 結(jié)論

①排空強飼法測定飼糧的AME值具有滿意的靈敏度。

②排空強飼法測定飼糧樣品間AME值是否有顯著差異的置信限為0.27 MJ/kg DM。

［1］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員.GB/T 26437—2010畜禽飼料有效性與安全性評價強飼法測定雞飼料表觀代謝能技術(shù)規(guī)程［S］.北京:中國標準出版社，2010.

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