黃曉燕，李明利，徐 娟，高躍東，王文廣，殷安國，李曉飛，孫曉梅，夏雪山，代解杰,*

1. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所 樹鼩種質(zhì)資源中心 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明650118；

2. 中國科學院昆明動物研究所 動物模型與人類疾病機理重點實驗室：免疫生物學實驗室，云南 昆明 650223；

3. 中國科學院昆明生物多樣性大型儀器區(qū)域中心，云南 昆明 650223；

4. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室，云南 昆明 650223；

5. 昆明理工大學 生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500

白細胞介素-2 (Interleukin-2,IL-2)為主要由激活淋巴細胞所產(chǎn)生的Th1型細胞因子，能促進T細胞、NK細胞及B細胞的分化成熟并激活其生物活性，誘導淋巴因子激活殺傷細胞 (LAK)，并通過淋巴因子和天然殺傷細胞破壞腫瘤細胞，以及促進諸多淋巴因子如干擾素及腫瘤壞死因子等的合成、釋放及抗體生成，增強機體免疫功能，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療等中具有重要作用 (Lenardo, 1991)。IL-2 還可作為免疫佐劑用于某些淋巴組織增生性疾病及癌癥的治療，其拮抗劑可用于抑制器官移植排斥反應 (Theze, 1996;Church, 2003)。人IL-2由位于第4號染色體長臂上的單一非等位基因編碼，由153個氨基酸組成，包括20個信號肽 (Gillis et al, 1979)。IL-2與受體結(jié)合后發(fā)揮作用，其受體由三種肽鏈α、β和γ參與構(gòu)成 (Shanafelt, 2000)。IL-2Rα為低親和力受體，單獨與IL-2結(jié)合后不參與信號轉(zhuǎn)導。T細胞表面表達由 α、β、γ三聚體構(gòu)成的高親和力受體參與，NK細胞表面表達由 β、γ二聚體構(gòu)成的中親和力受體參與 (Voss, 1991)，只有當IL-2和IL-2Rβ及IL-2Rγ結(jié)合后，才能通過其胞漿區(qū)的異源二聚體和信號旁路的一系列激酶活化發(fā)揮有效的信號轉(zhuǎn)導作用。該因子于1976年由Morgan et al報道，并由Taniguchi et al于1983年首次克隆成功。在人類醫(yī)學方面，重組IL-2在提高免疫抗病機能、抗感染和治療癌癥等方面獲得了廣泛應用 (Zelus et al，2000)。

樹鼩 (Tupaia belangeri, tree shrew)是生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類小型動物，形態(tài)酷似松鼠(Cao et al, 2003)，是靈長類動物的近親(Novacek ,1992; Nie ,2008)。由于樹鼩體型小、易馴養(yǎng)、繁殖能力強且飼養(yǎng)管理成本低，作為某些人類重大疾病研究的動物模型, 在醫(yī)學實驗中已被廣泛應用。早在1997年，Wang et al就發(fā)現(xiàn)樹鼩可感染人HCV。Zhao et al (2005)用HCV感染樹鼩原代培養(yǎng)肝細胞，結(jié)果在細胞培養(yǎng)上清液檢出HCV RNA,說明樹鼩肝外可支持HCV復制。Amako et al (2010)用HCV患者血清和HCV全長cDNA重組的病毒顆粒感染樹鼩，經(jīng)過長達3 a的觀察發(fā)現(xiàn)，HCV在樹鼩體內(nèi)可導致慢性肝炎、肝脂肪變性、肝纖維化、肝硬化結(jié)節(jié)及腫瘤發(fā)生等，表明樹鼩可作為模型動物用于研究丙型肝炎發(fā)病機制、預防治療及新藥研發(fā)。有研究表明，在慢性及重型丙型肝炎感染者血清中IL-2水平明顯上升，且其上升幅度與病情輕重和病程長短密切相關(guān) (Bozkaya,2000; Fukuda, 1996;Napoli,1996)。但目前對樹鼩IL-2的研究尚屬空白,致使缺乏對樹鼩動物模型免疫細胞因子方面的評價指標，因此，闡明樹鼩IL-2分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，是研究IL-2在丙型肝炎等疾病感染過程中免疫功能的前提。為此，本研究以確定樹鼩IL-2完整編碼序列為目的，對其進行分子特征分析，為今后制備樹鼩 IL-2單克隆抗體及研究白細胞介素在丙型肝炎中的免疫調(diào)節(jié)機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

自繁 F1代樹鼩由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供，按實驗動物使用的3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.2樹鼩IL-2 cDNA的分子克隆

由于樹鼩IL-2基因分子序列未見報道，我們首先根據(jù)取自NCBI數(shù)據(jù)庫樹鼩2倍覆蓋率基因組預測序列 (BioProject Accession: PRJNA13971)結(jié)合人IL-2編碼區(qū)設(shè)計上、下游引物(上游引物：5'-ATGCACAAAATGCAACTCTTGTCTTG-3',下游引物：5'-TCAACTCAGTGTTGAAATGATGCTTTG-3')。

無菌采集樹鼩外周血2 mL，用Ficoll-PaqueTM PREMIUM (購自GE Healthcare)分離外周血淋巴細胞，經(jīng) 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)及 ConA誘導 (1640液、胎牛血清購自TaKaRa) 后，收集淋巴細胞，提取細胞總RNA (試劑盒購自Thermo)。將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA (Revert Aid H Minus First strand cDNA synthesis Kit 購自 Thermo)，利用上述引物進行梯度PCR (Dream Taq Green PCR Master Mix 購自Thermo)，循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 61℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以樹鼩管家基因GAPDH(Glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase)作為陽性對照,其引物為5′-CCATCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′和 5′-C AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3′，退火溫度為52 ℃。將膠回收后的PCR產(chǎn)物 (膠回收試劑盒購自TIANGEN) 經(jīng)TA克隆插入pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切鑒定后，由invitrogen公司進行雙向測序。

1.3 分子特征分析

本文用于參比的核酸序列均來源于 GenBank數(shù)據(jù)庫，分別采用DNA MAN 6.0分析核酸序列、Clustal W 2.0分析氨基酸序列和MEGA 5.0分析樹鼩與其他哺乳動物IL-2之間的親緣關(guān)系，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的模建和分析則通過 Discovery Studio 和PyMOL 完成，信號肽和糖基化位點等則采用在線軟件預測 (http://www.cbs.dk/services)。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩IL-2全長編碼序列擴增

以經(jīng) ConA誘導培養(yǎng)的樹鼩淋巴細胞總 RNA為材料，反轉(zhuǎn)錄后由梯度PCR克隆出長度465 bp的核酸片段。將樹鼩IL-2 PCR產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆并雙向測序，得到樹鼩IL-2全長編碼序列（GenBank登錄號：KC170305），開放閱讀框長度為465 bp，編碼154個氨基酸(圖1)。

圖1 樹鼩IL-2核苷酸序列及對應氨基酸Figure 1 Nucleotide sequences and corresponding amino acids of tree shrew IL-2

2.2 樹鼩IL-2氨基酸序列分析

2.2.1 樹鼩IL-2整體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

樹鼩IL-2分子由154個氨基酸組成，屬于分泌蛋白，具有一個潛在的N-糖基化位點(NVT)，有2個與二硫鍵形成有關(guān)的半胱氨酸，整體結(jié)構(gòu)與人IL-2相似 (圖 2)。通過對樹鼩與其他哺乳動物的IL-2核苷酸序列對比發(fā)現(xiàn)，其與人及恒河猴的同源性較高 (分別為 91%和 93%)。我們利用 BlastP 及Clustal W 2.0對樹鼩與人 (NM_00586.3)、恒河猴(NM_001047130.3)、小鼠(NM_008366.3)、大鼠(NM_053836.1)、牛(NM_180997.1)及綿羊(NM_001009806.1)等哺乳動物的IL-2氨基酸序列進行比較分析 (圖3)，同樣發(fā)現(xiàn)樹鼩IL-2氨基酸序列與人及恒河猴同源性較高 (分別為80%及79%)，而與大鼠、小鼠的同源性較低 (分別為61%及53%)。同時，我們利用MEGA5.0軟件對樹鼩和上述哺乳動物的IL-2進行親緣關(guān)系分析并構(gòu)建進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樹鼩與人及恒河猴處于同一分支，而與大鼠、小鼠距離較遠，說明樹鼩在進化關(guān)系上更接近于人和恒河猴 (圖 3)。

圖3 樹鼩和其他哺乳動物IL-2之間的親緣關(guān)系 (bootstrap:10 000 replicates; method: Neighbour-Joining)Figure 3 Phylogenetic relationships of IL-2 chains from tree shrews and other mammals

2.2.2 樹鼩IL-2蛋白三維建模及表面電荷分布分析人IL-2主要由五個α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，存在一對二硫鍵，分別形成于Cys57和Cys105(Suzuki，2010)。通過Discovery Studio, 我們發(fā)現(xiàn)樹鼩IL-2整體結(jié)構(gòu)與人相似，在其結(jié)構(gòu)域中，能找到相對應的二硫鍵(圖4B)。同時，人IL-2分子中保守氨基酸殘基Phe42和Tyr45能形成疏水域，也是與IL-2Rα相結(jié)合的區(qū)域，Asn88和Asp20之間可形成分子內(nèi)氫鍵，也是與IL-2Rβ相結(jié)合的區(qū)域。其中，人IL-2分子中Asn88發(fā)生突變，會導致IL-2從IL-2-IL-2Rβ復合物上脫落， 而Ser127和Ser130殘基形成的區(qū)域是其與IL-2R ?相結(jié)合的區(qū)域 (圖4A)，在我們所獲得的樹鼩IL-2結(jié)構(gòu)域中的相應位置也可找到同樣的區(qū)域 (圖4B),推測其具有相對應的功能。

但是，在人IL-2結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)N-糖基化位點，而樹鼩 IL-2結(jié)構(gòu)中有一個N-糖基化位點。同一參數(shù)下的三維結(jié)構(gòu)比較顯示，人IL-2結(jié)構(gòu)中有5個α螺旋，而樹鼩IL-2結(jié)構(gòu)中有6個，且某一區(qū)域的不規(guī)則卷曲也存在差異 (圖4C，D)。此外，我們對人與樹鼩IL-2表面絕對電荷分布的分析表明，兩者所帶電荷基本相似，正、負電荷基本均等，但在某些區(qū)域，樹鼩表面正電荷較少 (圖4E，F(xiàn))。樹鼩IL-2分子中的 N-糖基化位點和表面電荷上與人 IL-2的差異可能影響其與其他蛋白分子的結(jié)合，這可能也解釋了我們實驗室使用鼠抗人 IL-2抗體不能與樹鼩IL-2發(fā)生交叉反應的原因。

圖4 人 (A、C、E) 和樹鼩 (B、D、F) IL-2蛋白三維結(jié)構(gòu)建模和表面絕對電荷比較Figure 4 Modeling of three-dimensional structures and surface charges of the domain of human (A,C,E) and tree shrew (B,D,F) IL-2 chains

3 討論

本研究確定了樹鼩IL-2基因全長編碼序列，并對其蛋白的同源關(guān)系與結(jié)構(gòu)域進行了分析。研究表明，樹鼩IL-2 cDNA序列和相應的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其它哺乳動物相近，其Phe42和Tyr45殘基可形成疏水域，Asn88和Asp20之間可形成分子內(nèi)氫鍵，根據(jù)已報道的人IL-2結(jié)構(gòu)與功能文獻 (Wang et al, 2005)，推測這兩個區(qū)域分別是與 IL-2Rα及 IL-2Rβ相結(jié)合的部位，而Gln127、Ser128和 Ser131殘基形成的區(qū)域是與IL-2R?相結(jié)合的區(qū)域，其中，Gln127與IL-2R ?Gln127及 Asn128之間可形成分子內(nèi)氫鍵。另外，推測樹鼩IL-2分子中 的Cys57和Cys106殘基可形成二硫鏈，這對維持其蛋白結(jié)構(gòu)及實現(xiàn)蛋白功能至關(guān)重要。但樹鼩IL-2分子中具有一個人IL-2分子中所不具備的N-糖基化位點，結(jié)合糖基化在維持蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間結(jié)合中的作用 (Lis & Sharon,1993)，推測樹鼩 IL-2與其受體及抗體的結(jié)合能力更強。另外，α螺旋數(shù)目和表面電荷分布的明顯差異仍有待對樹鼩 IL-2結(jié)構(gòu)與功能特點開展進一步分析。

Amako Y, Tsukiyama-Kohara K, Katsume A, Hirata Y, Sekiquchi S, Tobita Y, Hayashi Y, Hishima T, Funata N, Yonekawa M. 2010. Pathogenesis of hepatitis C virus infection in Tupaia belangeri. Journal of Virology, 84(1):303-311.

Bozkaya H, Bozdayi AM, Aslan N, Türkay C, Sarioglu M, ?etinkaya H,Akdogan M, Cinar K, Erden E, Kose K, Senturk H, Akkiz H, Karayalcin S,Yurdaydin C, Uzunalimoglu O. 2000. Circulating IL-2 and IL-10 in chronic active hepatitis C with respect to the response to IFN treatment. Infection,28(5): 309-313.

Cao J, Yang EB, Su JJ, Li Y, Chow P. 2003. The tree shrews: Adjuncts and alternatives to primates as models for biomedical research. Journal of Medical Primatology, 32(3): 123-130.

Church A C. 2003. Clinical advances in therapies targeting the interleukin-2 receptor. QJM: An International Journal of Medicine, 96(2): 91-102.

Fukuda R, Ishimura N, Ishara S, Chowdhury A, Morlyama N, Nogami C,Miyake T, Niigaki M, Tokuda A, Satoh S, Sakai S, Akagi S, Watanabe M,Fukumoto S. 1996. Intrahepatic expression of pro-inflammatory cytotine mRNA and interferon efficacy in chronic hepatitis C. Liver, 16: 390-399.

Gillis S, Union NA, Baker PE, Smith KA. 1979. The in vitro generation and sustained culture of nude mouse cytolytic T-lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine, 149(6): 1460-1476.

Lenardo M J. 1991. Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis. Nature, 353(6347): 858-861.

Lis H, Sharon N. 1993. Protein glycosylation. Structural and functional aspects. European Journal of Biochemistry, 218(1): 1-27.

Morgan DA, Ruscetti FW, Gallo R. 1976. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows. Science, 193(4257):1007-1008.

Napoli J, Bishop GA, McGuinness PH, Painter DM, McCaughan GW. 1996.Progressive liver injury in chronic hepatitis C infection correlates with increased intrahepatic expression of Th1-associated cytokines. Hepatology,24(4): 759-765.

Novacek MJ. 1992. Mammalian phylogeny: shaking the tree. Nature,356(6365): 121-125.

Nie W, Fu B, O'Brien PC, Wang J, Su W, Tanomtong A, Volobouev V,Ferguson-Smith MA, Yang F. 2008. Flying lemurs—the‘flying tree shrews’?Molecular cytogenetic evidence for a Scandentia-Dermoptera sister clade.BMC biology, 6:18.

Shanafelt AB, Lin Y, Shanafelt MC, Forte CP, Dubois-Stringfellow N,Carter C, Gibbons JA, Cheng SL, Delaria KA, Fleischer R, Greve JM,Gundel R, Harris K, Kelly R, Koh B, Li Y, Lantz L, Mak P, Neyer L, Plym MJ, Roczniak S, Serban D, Thrift J, Tsuchiyama L, Wetzel M, Wong M,Zolotorev A. 2000. A T-cell-selective interleukin-2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo. Nature Biotechnol, 18(11):1197-1202.

Suzuki S, Konnai S, Okagawa T, Githaka NW, Kariukit E, Gakuyat F,Kanduma E, Shirai T, Ikebuchi R, Ikenaka Y, Ishizuka M, Murata S, Ohashi K. 2012. Molecular cloning and characterization of Th1 and Th2 cytokines of African buffalo(Syncerus Caffer). International Journal of Immunogenetics, 39(2): 170-182.

Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R,Hamuro J. 1983. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2. Nature, 302(5906): 305-310.

Theze J, Alzari PM, Bertoglio J. 1996. Interleukin 2 and its receptors: recent advances and new immunological functions. Immunology Today, 17(10):481-486.

Voss SD, Sondel PM, Robb RJ. 1992. Characterization of the interleukin-2 receptors(IL-2R) expressed on human nature killer cells activated in vivo by IL-2: association of the p64 IL-2R gamma chain with the IL-2R beta chain in functional intermediate-affinity IL-2R. The Journal of Experimental Medicine, 176(2): 531-541.

Wang HP, Zhou YX, Yao ZQ, Hong S, Li GY. 1997. The preliminary study of infection of major tupaia with hepatitis C virus. Journal of the Fourth Military Medical University, 18(4): 375-376. [王海平, 周永興, 姚志強,洪沙, 李光玉. 1997. 成年樹鼩實驗感染丙型肝炎病毒的初步研究. 第四軍醫(yī)大學學報, 18(4): 375-376]

Wang X, Rickert M, Garcia KC. 2005. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its α, β and γc receptors. Science, 310(5751):1159-1163.

Zelus D, Robinson-Rechavi M, Delacre M, Auriault C, Laudet V. 2000. Fast evolution of interleukin-2 in mammals and positive in ruminants. Journal of Molecular Evolution, 51(3): 234-244.

Zhao XP, Tian ZF, Chen YC, Yang C, Tian DY, Yang DL, Hao LJ. 2005.Infection of tupaia hepatocytes with hepatitis C virus in vitro. Chinese Journal of Hepatology, 13(11): 805-807. [趙西平, 田展飛, 陳義春, 楊春,田德英, 楊東亮, 郝連杰. 2005. 丙型肝炎病毒體外可感染樹鼩肝細胞.中華肝臟病雜志, 13(11): 805-807.