蘇靜緣， 李曉明， 齊廣偉， 梁國(guó)標(biāo)

近幾年，科學(xué)研究人員先后提出缺血預(yù)處理(Ischemic Preconditioning，IP)，缺血后處理(Ischemic Postconditioning，IPC)，遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理(Remote Ischemic Preconditioning，RIP)和 RIPC 的概念，并證明了這些處理方法能發(fā)揮內(nèi)源性機(jī)制對(duì)CIR損傷具有保護(hù)作用［1～4］。

微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈(MAP1-LC3)是哺乳動(dòng)物自噬體形成相關(guān)蛋白，當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3的含量及LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化均明顯增加。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3表達(dá)變化，可以方便地判斷細(xì)胞狀態(tài)，判斷其自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制［5］。自噬體形成后，溶酶體與之融合，釋放溶酶體酶，將自噬泡中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器消化溶解;Ellis等人報(bào)道，缺血Cathepsin B的小鼠有神經(jīng)元丟失，腦萎縮等現(xiàn)象的出現(xiàn)，說(shuō)明Cathepsin B能維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能［6］。

本文采用了大鼠腦缺血再灌注(CIR)模型，檢驗(yàn)RIPC對(duì)CIR的保護(hù)作用，比較后處理和模型組LC3和Cathepsin B表達(dá)的差異性，旨在闡述自噬-溶酶體在RIPC對(duì)CIR的影響中的作用，為RIPC對(duì)CIR的保護(hù)機(jī)制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔健康雄性SD大鼠42只，體重210～260g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前12h禁食，自由飲水。將 SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(Sham，n=10)，缺血再灌注 3h 組(I/R3h，n=6)，缺血再灌注24h組(I/R24h，n=10)，缺血再灌注3h+下肢缺血后處理組(RIPC3h，n=6)，缺血再灌注24h+下肢缺血后處理組(RIPC 24h，n=10)。

1.2 主要試劑和儀器 一抗LC3購(gòu)自sigma公司;Cathepsin B購(gòu)自武漢博士德試劑公司;二抗試劑購(gòu)自北京中杉金橋公司PV6001;DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司ZLI9031;2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)購(gòu)自sigma公司。

1.3 制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型模型組和處理組缺血再灌注均采用Longa法［7］制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，用10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中縱向切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，在靠近頸外動(dòng)脈根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈，近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，血管夾夾閉其遠(yuǎn)端，并在結(jié)扎線和血管夾之間的頸總動(dòng)脈上剪一小口，切口遠(yuǎn)心端打一松口，將尼龍線自剪口處插入，縛緊缺血遠(yuǎn)端的絲線，松開(kāi)血管夾，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈到大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，至有阻力不能再進(jìn)為止，插線長(zhǎng)度約18～20cm(從分叉處算)。剪斷線頭、縫皮。假手術(shù)組不進(jìn)線外，其余過(guò)程同缺血組。正常組不干預(yù)。在灌注組在缺血90min后輕輕抽出魚(yú)線至有阻力感，表明線頭已退出至頸總動(dòng)脈剪口處。術(shù)中保持動(dòng)物肛溫37℃左右。

1.4 下肢缺血后處理的介入 分離大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈主干，在缺血即刻使用動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈15min，再放開(kāi)15min，重復(fù)3次。假手術(shù)組和對(duì)照組僅分離股動(dòng)脈，不做任何處理。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 麻醉蘇醒后，將動(dòng)物放回鼠籠，自由飲食。參照 Garcia評(píng)分法［8］，各組 CIR后24h采用雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。Garcia評(píng)分從大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱(chēng)性、前肢伸展功能、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)觸覺(jué)、雙側(cè)胡須反射等6方面評(píng)定大鼠神經(jīng)功能損傷程度;功能正常時(shí)得分最高，18分;功能損傷最嚴(yán)重者得分最低，3分(見(jiàn)表1)［9］。

表1 Garcia大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 腦梗死體積的檢測(cè) 假手術(shù)組，缺血再灌注24h組，缺血再灌注24h+下肢缺血后處理組隨機(jī)取4只鼠進(jìn)行TTC染色。鼠再灌注24h后，過(guò)量麻醉致死，斷頭取腦，用生理鹽水沖洗后放于-20℃冰箱冷凍20min;將腦沿冠狀面切4刀，切成5片，迅速將腦片置10ml的1%的TTC溶液中，放入37℃溫箱15～30mim，其間每10min翻動(dòng)一次，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗死區(qū)呈白色。將染后的腦組織置10%的福爾馬林溶液中固定24h。固定后拍照，用電腦圖像分析系統(tǒng)(Image Pro plus 6.0)測(cè)定腦梗死體積。

1.7 取材及切片 各組鼠被過(guò)量麻醉致死后，斷頭取腦進(jìn)行24h、4%多聚甲醛固定，自視交叉向前后2mm切取冠狀腦片，取腦片，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和切片，作HE染色和免疫組化染色。

1.8 LC3和Cathepsin B免疫組織化學(xué)染色切片常規(guī)脫蠟至水;蒸餾水洗凈后檸檬酸微波修復(fù)15min，自然冷卻至室溫，PBS洗;3%過(guò)氧化氫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗;10%BSA封閉10min;滴加一抗(LC3 1∶400，Cathepsin B 1∶200)，至于濕盒中，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗;滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗;DAB顯色，充分水洗;蘇木素淺染5min，充分水洗;酒精脫水，二甲苯透明，封片。每例大鼠隨機(jī)取6張切片，在缺血再灌注側(cè)皮質(zhì)半暗帯區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)不重疊高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)含棕黃色顆粒)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用 SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)以±s表示，差異顯著性檢測(cè)采用方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血閉塞90min再灌注24h后，除假手術(shù)組外，各組動(dòng)物出現(xiàn)明顯神經(jīng)缺損癥狀，大多表現(xiàn)為不同程度的左側(cè)前肢屈曲、向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，行走時(shí)向左側(cè)傾倒;RIPC組大鼠神經(jīng)功能缺陷癥狀比I/R組明顯減輕。各組評(píng)分相比較，差異有顯著性(P＜0.01，見(jiàn)表2)。

表2 RIPC對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響(χ ± s，n=10)

2.2 大鼠腦梗死體積 RIPC能減少CIR后腦梗死體積。圖1為再灌注24h后，TTC染大腦梗死體積結(jié)果，可見(jiàn)正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗死區(qū)呈白色，可見(jiàn)缺血組白色區(qū)域大于后處理組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明RIPC組大鼠腦梗死體積明顯低于缺血模型組(P ＜0.01)。

圖1 TTC檢測(cè)RIPC對(duì)大鼠腦梗死體積的影響

2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 HE染色后光鏡下組織學(xué)所見(jiàn)，CIR后可見(jiàn)梗死灶和缺血半暗帯，梗死灶中心腦組織發(fā)生液化性壞死，神經(jīng)氈溶解，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元的核固縮，胞體縮小變形，胞質(zhì)尼氏小體消失，HE染色胞質(zhì)呈深伊紅色的紅色神經(jīng)元。RIPC組腦組織損傷程度明顯低于單純?nèi)毖M，假手術(shù)組基本正常(見(jiàn)圖2)。

圖2 RIPC影響CIR的HE結(jié)果(×400;A:Sham組;B:I/R24h組;C:RIPC24h組)

2.4 RIPC對(duì) CIR損傷后LC3和Cathepsin B表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:LC3和Cathepsin B陽(yáng)性細(xì)胞主要位于缺血側(cè)梗死灶周?chē)陌氚祹窠?jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)含棕黃色顆粒。假手術(shù)組LC3和Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)水平均較低;缺血再灌3h組大鼠大腦缺血半球皮質(zhì)LC3和Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增加(P＜0.05);RIPC再灌后3h組LC3和Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)水平較假手術(shù)組有明顯增加(P＜0.05)，與缺血組無(wú)顯著差異(見(jiàn)表3、圖3)。

表3 再灌注3h后各組LC3，Cathepsin B表達(dá)情況(±s)

表3 再灌注3h后各組LC3，Cathepsin B表達(dá)情況(±s)

組間兩兩比較*P＜0.05vs sham組

組別LC3 Cathepsin B Sham I/R3h RIPC3h 4.85 ±0.39 21.2 ±0.66*20.93 ±0.75*5.59 ±0.25 13.93 ±0.20*13.54 ±0.25*

圖3 各組再灌注3h后LC3，Cathepsin B免疫組織化學(xué)染色(×400)

缺血再灌注24h組大鼠大腦缺血半球皮質(zhì)半暗帯區(qū)LC3陽(yáng)性表達(dá)水平下降至與假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異;但RIPC再灌注24h組LC3陽(yáng)性表達(dá)與缺血再灌注24h組比較存在明顯的差異(P＜0.05)。RIPC再灌注24h組大鼠大腦缺血半球皮質(zhì)半暗帯區(qū)Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)水平與假手術(shù)組比較有明顯差異，并且與缺血再灌注24h組比較也存在明顯的差異(P ＜0.05，見(jiàn)表4、圖4)。

表4 再灌注24h后各組LC3，Cathepsin B表達(dá)情況(±s)

表4 再灌注24h后各組LC3，Cathepsin B表達(dá)情況(±s)

組間兩兩比較*P＜0.05vs sham組;#P＜0.05vs I/R24h組

組別LC3 Cathepsin B Sham I/R24h RIPC24h 4.80 ±0.48 4.96 ±0.24 20.22 ±0.25*#5.58 ±0.24 7.88 ±0.38*14.02 ±0.35*#

圖4 各組再灌注24h后LC3，Cathepsin B免疫組織化學(xué)染色(×400)

3 討論

近年來(lái)已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道IPC在動(dòng)物CIR中具有神經(jīng)保護(hù)作用。由于腦的特殊性，很難直接將IPC應(yīng)用于CIR損傷的治療。RIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RIPC應(yīng)用的可能性，同時(shí)，也為CIR的治療提供了可行性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠線栓法制備了大鼠CIR模型，模擬人類(lèi)CIR損傷，在腦缺血即刻給予RIPC的大鼠，經(jīng)TTC染色和神經(jīng)功能評(píng)分均提示RIPC能減少CIR損傷后腦梗死體積和改善大鼠的神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)也運(yùn)用HE染色，從微觀形態(tài)方面進(jìn)一步證明RIPC能明顯減輕CIR后腦的損傷，改善腦功能;RIPC能有效的抑制神經(jīng)元的損傷和神經(jīng)凋亡;經(jīng)RIPC的腦組織，半暗帯較缺血組的小，神經(jīng)氈溶解程度較缺血組的輕。這與 Ren等人［4］和 Zhou等人［10］的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)越早實(shí)施RIPC，越能更好的保護(hù)CIR損傷［11］。

自噬是通過(guò)自噬溶酶體系統(tǒng)對(duì)自身細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異物、損傷和衰老細(xì)胞器進(jìn)行吞噬降解的過(guò)程，它可以使蛋白等能量物質(zhì)循環(huán)再利用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，器官正常發(fā)育具有重要的作用。大鼠局灶性CIR損傷后能激活自噬溶酶體途徑［12］。在本研究中，我們研究RIPC對(duì)CIR的神經(jīng)保護(hù)作用是否與自噬有關(guān)。

我們應(yīng)用LC3免疫組化定位檢測(cè)自噬體表達(dá)情況，結(jié)果表明應(yīng)用RIPC的腦組織半暗帯區(qū)自噬體增多。Sheng等人［13］在研究預(yù)處理對(duì)CIR的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬在預(yù)處理刺激后表達(dá)增加;Qi等人［14］在研究RIPC對(duì)大鼠CIR的保護(hù)作用中也發(fā)現(xiàn)自噬有助于RIPC對(duì)大腦的神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究均提示RIPC對(duì)CIR損傷的保護(hù)作用與自噬有關(guān)。

如前所述，AKT/GSK3β是RIPC對(duì)CIR損傷保護(hù)作用的重要信號(hào)通路［2，9］。最近也有研究提供證據(jù)，AKT/GSK3β是自噬誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵分子。Qi等人研究闡述RIPC上調(diào)AKT和GSK3β磷酸化;若應(yīng)用AKT通路抑制劑LY294002，通過(guò)抑制GSK3β磷酸化可阻滯RIPC誘導(dǎo)的自噬體的形成;提示AKT/GSK3β磷酸化在RIPC上調(diào)自噬中有重要作用［14］。

盡管自噬誘導(dǎo)Ⅱ型程序性死亡，但自噬的保護(hù)作用在最近缺血研究中已經(jīng)被闡述［13］。本實(shí)驗(yàn)闡述了自噬在RIPC保護(hù)CIR損傷中的作用，特別是半暗帯區(qū)。溶酶體是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的主要場(chǎng)所，被稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)的消化器官。自噬活動(dòng)促進(jìn)了溶酶體酶的形成和活化，自噬體中被包裹的細(xì)胞器等物質(zhì)最終在溶酶體中被溶酶體酶降解。溶酶體含有多種溶酶體酶，自噬活動(dòng)促進(jìn)了溶酶體酶的形成和活化，其中Cathepsin B是半胱氨酸蛋白酶類(lèi)之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Cathepsin B免疫組化結(jié)果顯示，RIPC組較I/R組Cathepsin B表達(dá)增加，這可能與RIPC的腦保護(hù)作用有關(guān)。也有研究表明Cathepsin B是自噬和凋亡的分子聯(lián)系［15］。

雖然我們闡述了自噬可能與RIPC保護(hù)CIR損傷有關(guān)，但自噬減少缺血再灌注損傷的機(jī)制仍然不十分清楚。這可能是應(yīng)用RIPC在早期缺血再灌注損傷時(shí)提高自噬活動(dòng)，通過(guò)快速清理浪費(fèi)的或者有害的信號(hào)通路和組織細(xì)胞內(nèi)的毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)以保護(hù)神經(jīng)元;另外，自噬還可能有助于高分子降解以補(bǔ)償卒中后腦內(nèi)能量的耗竭。然而，RIPC的神經(jīng)保護(hù)作用中自噬溶酶體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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