孟翔翔，狄曉艷，王孟本，* ，朱世忠，趙天梁

(1.山西大學(xué)黃土高原研究所，太原 030006;2.山西省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，太原 030001)

油松是我國(guó)特有樹種，其自然分布范圍廣闊，介于31°—44°N和101°30'—124°25'E之間，呈非連續(xù)或島嶼狀分布格局［1-2］。天然地理屏障可能會(huì)阻礙種群間基因交流，導(dǎo)致種群間遺傳分化增大［3-4］。核DNA遺傳標(biāo)記研究顯示，油松的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間已具有一定的遺傳分化［5］。

關(guān)于山脈屏障對(duì)植物遺傳分化的作用，已有人做了大量研究工作，但結(jié)果卻不盡相同。已有研究表明，山脈是美國(guó)短葉松(Pinus banksiana)［6］、中國(guó)青楊(populus cathayana)［7］、海岸松(Pinus pinaster)［8］基因交流和遷移的重要屏障，從而引起其遺傳譜系產(chǎn)生隔離;但山脈對(duì)歐洲水青岡(Fagus sylvatica)［9］和水曲柳(Fraxinus mandshurica)［10］種群遺傳分化卻沒有顯著作用。研究同時(shí)表明，東西走向山脈的阻隔作用是歐洲大陸第四紀(jì)冰期前后植物類群的差異大于北美大陸的重要因素［11］;東北-西南走向的山脈阻礙了白木香(Aquilaria sinensis)譜系間的基因交流，而對(duì)于走向與白木香擴(kuò)張方向一致的山脈，其卻不阻礙白木香譜系間的基因交流［12］。

秦嶺是中國(guó)重要的南北自然分界線，呈東西向橫亙于中國(guó)中部，橫跨甘肅、陜西、河南三省。它既是我國(guó)亞熱帶與暖溫帶氣候的分界線，也是常綠闊葉林與落葉闊葉林的分界線［13］。賀蘭山位于阿拉善高原與銀川平原之間，大致呈南-北走向，是我國(guó)西北干旱區(qū)與半干旱區(qū)的分界線，也是溫帶荒漠與溫帶荒漠草原的分界線［14］。

在第四紀(jì)冰期氣候波動(dòng)的影響下，松科植物(如油松)可能發(fā)生了與歐洲和北美相似的向南退縮和向北擴(kuò)展的過(guò)程［15-16］，其線粒體為母系遺傳，更容易反映群體分化的模式［4，17-19］?；诖?，本研究以分布于秦嶺、賀蘭山和晉陜兩省的10個(gè)天然油松種群為研究對(duì)象，采用線粒體DNA序列測(cè)定技術(shù)，對(duì)種群的單倍型進(jìn)化關(guān)系以及種群的聚類特點(diǎn)等進(jìn)行研究，以探究地理阻隔對(duì)油松遺傳結(jié)構(gòu)的影響。此項(xiàng)研究對(duì)深入認(rèn)識(shí)油松遺傳結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制具有一定意義，同時(shí)可為進(jìn)一步探討中國(guó)北方植物區(qū)系現(xiàn)存分布格局形成機(jī)制提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選取了來(lái)自秦嶺、賀蘭山和晉陜兩省的10個(gè)天然油松種群共100個(gè)個(gè)體的針葉樣品。每個(gè)種群取樣10個(gè)，個(gè)體之間距離大于100 m。所采針葉置于硅膠中迅速干燥，密封于塑料口袋帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃下保存?zhèn)溆?。油松采樣地點(diǎn)概況［5］見圖1和表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法［20］，從硅膠干燥的針葉中提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

分別采用線粒體nad1內(nèi)含子(f-gAT Cgg CCA TAA Atg TAC TCC，r-CCC CAT ATA TAT TCC Cgg AgC［21］)和matR內(nèi)含子(f-CgA CAg AAg CAC gAA ATT CC，r-ACC CgA CgA TAA CTA gCT TC［22］)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)為 25 μl，其中含有 1×PCR buffer，總 DNA 30—50 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，taq 酶 1 U，引物 0.4 μM;反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性 30 s，54 ℃(nad1)/58℃ (matR)退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Gel Extraction Kit純化試劑盒(bio-tec OMEGA，USA)按推薦步驟進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送往上海立菲生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理:

采用MEGA 5.1中的ClustalX軟件對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)(并進(jìn)行適當(dāng)手工校正)，以得到不同序列(即不同單倍型)。同時(shí)采用MEGA 5.1中的相應(yīng)模塊對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、各堿基含量、核苷酸多樣性進(jìn)行計(jì)算;對(duì)單倍型間和種群間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離進(jìn)行計(jì)算;并構(gòu)建種群鄰接聚類圖。采用NETWORK 4.6.1.1軟件 (http://www.fluxus-engineering.com)［23］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。采用PHYLIP 3.69軟件中的最大簡(jiǎn)約法(MP)構(gòu)建單倍型聚類圖。采用ARLEQUIN軟件中的AMOVA對(duì)種群間的遺傳分化是否顯著進(jìn)行檢驗(yàn)。

圖1 10個(gè)天然油松種群的地理位置(黑點(diǎn))及其單倍型分布概況(餅狀圖)Fig．1 Geographic location(black dots)of the 10 natural populations of Pinus tabulaeformis，and their mitotype distribution(pie chart)Hli等為種群代號(hào)(詳見表1);不同顏色代表不同的單倍型

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA序列變異與單倍型

比對(duì)后的10個(gè)天然油松種群的100個(gè)個(gè)體線粒體DNA的nad1片段長(zhǎng)度為1093—1280 bp，校正后長(zhǎng)度為1366 bp，共包括168個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中34個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，134個(gè)單變位點(diǎn)。線粒體matR片段長(zhǎng)度為475—477 bp，校正后長(zhǎng)度為478 bp，共包括4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中1個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，3個(gè)單變位點(diǎn)，核苷酸 T、C、A、G平均比例分別為 25.83%(25.44%—26.58%)、23.94%(23.17%—24.16%)、22.17%(21.92%—22.98%)、28.06%(27.01%—28.41%)，A+T含量(48%)略低于C+G含量(52%)。序列變異含有堿基缺失/插入和堿基替換等，共得到27個(gè)單倍型(表1)，其中單倍型h1為所用種群所共有，占所有個(gè)體數(shù)的54%，是分布最廣的單倍型;單倍型h3分布于HLn，HL和TY種群中，單倍型h6分布于HLn、HLi和ZZ種群，單倍型h9分布于HLn和NX種群，單倍型h27分布于HLn、LY、GD、LC和HL5個(gè)種群中，其余22個(gè)單倍型僅存在于單個(gè)種群中。由此可見，兩個(gè)種群(LC和NS)僅有共有單倍型，而其余種群則分別具有1—4個(gè)獨(dú)有單倍型。

表1 供試油松種群的地理位置及其單倍型類型Table 1 Geographic location of the populations of Pinus tabulaeformis，and their haplotypes

就位于秦嶺或賀蘭山兩側(cè)的種群而言，秦嶺南側(cè)的NS和NX種群與秦嶺北側(cè)的ZZ和LC種群有一個(gè)共有單倍型，賀蘭山東西兩側(cè)的HLn和HLi種群具有兩個(gè)共有單倍型。秦嶺南側(cè)NX種群和北側(cè)ZZ種群分別具有兩個(gè)和一個(gè)獨(dú)有單倍型;賀蘭山東側(cè)種群(HLn)和西側(cè)種群(HLi)均具有3個(gè)獨(dú)有單倍型。相比之下，晉陜種群(即油松分布區(qū)中心種群HL、TY、GD和LY)則分別具有2—4個(gè)獨(dú)有單倍型。由此可見，秦嶺種群或賀蘭山種群的獨(dú)有單倍型平均數(shù)目(分別為3/4和6/2)明顯小于分布區(qū)中心種群(13/4)。

2.2 單倍型間的進(jìn)化關(guān)系

如圖2所示，27個(gè)單倍型且可合并為12個(gè)單倍型(其中h1—h14合并為h1，h25—h27合并為h25)，其分布大致呈三葉草形，h25位于交匯中心，主要涉及GD與LY，LC，HL和HLn種群;h22和h23獨(dú)立為一支，分別涉及HLi和HLn種群;h1，h16、h17和h20、h21為一支，其中h16和h17為TY種群的獨(dú)有單倍型，h20和h21為NX種群的獨(dú)有單倍型;h18，h19和h24形成第三支，分別為L(zhǎng)Y，ZZ和HLn種群的獨(dú)有單倍型。由此可知，各種群?jiǎn)伪缎椭g的關(guān)系比較復(fù)雜。盡管如此，從圖2仍然可以看出，位于賀蘭山東西兩側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h22和h23)緊鄰且獨(dú)成一支。位于秦嶺南北兩側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h20，h21與h19)之間僅存在三個(gè)進(jìn)化節(jié)點(diǎn)，說(shuō)明其關(guān)系較近。同時(shí)可以看出，位于賀蘭山東側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h23)與晉陜種群的某些獨(dú)有單倍型(h25和h15)的關(guān)系也比較近。位于秦嶺北側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h19)與晉陜種群的獨(dú)有單倍型(h18、h25和h15)的關(guān)系同樣較近。

圖2 油松種群27個(gè)單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig．2 Network relationship chart of the 27 haplotypes from Chinese pine populationsh代表單倍型，h1包括單倍型h1—14，h25包括h25—27，圓圈大小代表單倍型頻率，不同顏色代表不同的種群;圖例解釋見表1

從圖3同時(shí)可以看出，這些單倍型可大致聚為3組。其中單倍型h1-h15(除h7之外)為第一組，單倍型h16-h24為第二組，單倍型h25，h26，h27和h7為第三組。圖3中的第一組單倍型(除h15)和第三組單倍型(除h7)在圖2中各自為一個(gè)單倍型(h1和h25)，同樣表明第一組或第三組各個(gè)單倍型有著更近的親緣關(guān)系。然而，在第一組中，單倍型h9，h13和h3，h10分別存在于賀蘭山東西兩側(cè)種群之中(其中h13和h10分別為獨(dú)有單倍型);h9和h6分別存在于秦嶺的南北兩側(cè)種群之中。在第二組中，則顯示出與圖2相類似的結(jié)果，即h18，h19和h24為一亞組，h22和h23為一亞組;h16、h20和h21為一亞組。總體來(lái)看，在秦嶺南北兩側(cè)和賀蘭山東西兩側(cè)的3對(duì)種群9個(gè)獨(dú)有單倍型中，有8個(gè)獨(dú)有單倍型的關(guān)系較近(h19與h20，h19與h21，h13與h10，h24與h22，h22與h23)。與此同時(shí)，位于秦嶺北側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h19)與晉陜種群的獨(dú)有單倍型(h17和h18)的關(guān)系也比較近。位于賀蘭山東側(cè)種群的獨(dú)有單倍型(h23和h24)與晉陜種群的某些獨(dú)有單倍型(h16、h17和h18)的關(guān)系同樣較近。

以上分析說(shuō)明，油松種群?jiǎn)伪缎烷g的親緣關(guān)系比較復(fù)雜。秦嶺、賀蘭山和晉陜3組種群之間不僅具有共有單倍型，多數(shù)種群且具有各自的獨(dú)有單倍型。但是，位于秦嶺或賀蘭山兩側(cè)種群的獨(dú)有單倍型之間的關(guān)系有時(shí)(如圖2所示)甚或往往(如圖3所示)較近。而且秦嶺北側(cè)或賀蘭山東側(cè)種群的獨(dú)有單倍型與油松分布區(qū)中心種群的某些獨(dú)有單倍型的關(guān)系亦較近。這意味著山脈地理屏障與油松的遺傳分化沒有明顯關(guān)系。

2.3 種群遺傳多樣性和遺傳距離

圖3 油松27個(gè)單倍型的最大簡(jiǎn)約(MP)聚類圖Fig.3 Cluster result of 27 mtDNA haplotypes of Pinus tabulaeformis using maximum parsimony(MP)method

油松種群線粒體nad1和matR序列分析表明，總體水平(100個(gè)個(gè)體)的單倍型多樣性為0.7120，核苷酸多樣性為0.0050(表2)。種群內(nèi)單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0—0.9111和0—0.0176。其中NX種群核苷酸多樣性最高，其次為TY、LC、ZZ種群，而NS種群核苷酸多樣性最低。AMOVA分析表明(表3)，所有種群的90.16%的遺傳變異分布于種群內(nèi)，9.84%的遺傳變異分布于種群間。但是種群間遺傳分化仍然很顯著。對(duì)秦嶺、賀蘭山和晉陜3組種群而言，秦嶺種群間或晉陜種群間遺傳分化極顯著，而賀蘭山種群間遺傳分化則不顯著。

表2 油松種群的單倍型多樣性(Hm)和核苷酸多樣性(π)Table 2 Haplotype diversity(Hm)and nucleotide diversity(π)for 10 nature populations of Pinus tabulaeformis

表3 基于線粒體序列的天然油松種群的分子方差分析(AMOVA)Table 3 Analysis of molecular variance(AMOVA)of mitotypes in the populations of Pinus tabulaeformis

從種群之間的遺傳距離(表4)可知，NX種群與其他種群之間的遺傳距離均比較大，其次為TY種群。如圖4所示，若以0.0015為臨界值，可將供試種群分為6組，即HLi和HLn各為一組，LY、GD和LC為一組，HL、NS和ZZ為一組，NX和TY各為一組。說(shuō)明油松種群間的聚類關(guān)系比較復(fù)雜。很顯然，這種聚類關(guān)系與油松單倍型間的復(fù)雜進(jìn)化關(guān)系密切相關(guān)。

表4 油松種群間的遺傳距離Table 4 Genetic distance among the 10 populations of Pinus tabulaeformis

盡管秦嶺南、北兩側(cè)種群(NS與ZZ)或賀蘭山東、西兩側(cè)種群(HLi與HLn)的聚類關(guān)系較近，但是由于NX和TY各分為一組，而LC歸為另一組，秦嶺南、北兩側(cè)種群與油松分布區(qū)中心種群之間表現(xiàn)出復(fù)雜的聚類關(guān)系。同樣由于TY單獨(dú)為一組，HLi與HLn各為一組，賀蘭山東西兩側(cè)種群與油松分布區(qū)中心種群之間亦表現(xiàn)出比較復(fù)雜的關(guān)系。這從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明，位于秦嶺南北兩側(cè)或賀蘭山東西兩側(cè)種群之間的遺傳分化與山脈屏障的存在沒有明顯關(guān)系。

圖4 基于Kimura雙參數(shù)距離的油松天然種群的鄰接聚類圖Fig．4 Neighbor-joining tree based on Kimura 2-parameter distance in populations of Pinus tabulaeformis

3 討論

遺傳多樣性是物種適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)。遺傳多樣性的高低可以在一定程度上反映物種的進(jìn)化過(guò)程、進(jìn)化潛力，以及物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。松科植物線粒體基因具有母系遺傳特性，不經(jīng)歷重組，能更直接地反映植物的進(jìn)化特征。對(duì)mtDNA序列的分析顯示，在供試油松種群中共檢測(cè)到27個(gè)單倍型。單倍型h1為各種群所共有，可能為一個(gè)古老單倍型。除h3，h6，h9和h27這4個(gè)單倍型為2—5種群共有之外，其余22個(gè)單倍型分別為8個(gè)種群所獨(dú)有。整體而言，油松具有較高的單倍型多樣性(0.7120)和核苷酸多樣性(0.0050)。盡管遺傳多樣性主要存在于種群內(nèi)(90.16%)，種群間遺傳分化仍然很顯著(Fst=0.0984，P＜0.001)。這與已有研究結(jié)果［5，24-25］相一致。由此可見，油松種群在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中的確產(chǎn)生了明顯分化。

山脈尤其是東西走向的山脈，在第四冰期時(shí)對(duì)種群的分子進(jìn)化可能起到重要作用［26］。山脈主要是通過(guò)阻礙花粉和種子傳播，從而影響基因流，導(dǎo)致種群間的遺傳分化。種群遺傳分化程度通常用遺傳分化指數(shù)(Fst)表示。本研究顯示，與晉陜種群的遺傳分化指數(shù)(0.2239)相比，秦嶺種群的遺傳分化指數(shù)(0.0122)和賀蘭山種群的遺傳分化指數(shù)(-0.0264)均較小(盡管秦嶺種群或晉陜種群的遺傳分化顯著，而賀蘭山種群的遺傳分化不顯著)(表3)。這意味著山脈屏障與油松的遺傳分化沒有多大關(guān)系。

賀蘭山種群的遺傳分化指數(shù)為負(fù)值，且種群內(nèi)變異超過(guò)了100%(102.64%)。根據(jù)葉瑩瑩等的對(duì)類似結(jié)果的分析［27］，可以認(rèn)為賀蘭山兩側(cè)的兩個(gè)油松種群間無(wú)遺傳分化。這同樣說(shuō)明賀蘭山對(duì)其兩側(cè)油松種群的遺傳分化幾乎沒有任何影響。

就單倍型而言，盡管秦嶺南、北側(cè)或賀蘭山東、西側(cè)種群各有自己的獨(dú)有單倍型，但與晉陜種群相比，其獨(dú)有單倍型的平均數(shù)較小。盡管各種群?jiǎn)伪缎椭g的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，但是從單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系和最大簡(jiǎn)約聚類圖中仍然可以比較清楚地看出，位于秦嶺南北兩側(cè)或賀蘭山東西兩側(cè)種群的獨(dú)有單倍型之間關(guān)系往往比較接近(如圖2中h19與h20和h21;h22與h23;圖4中h19與h20，h19與h21;h13與h10，h22與h24，尤其是h22與h23)。已有油松譜系地理學(xué)研究也表明，太白山種群和寧陜種群之間沒有明顯遺傳分化［4］。這些分析說(shuō)明，油松的遺傳結(jié)構(gòu)與其分布區(qū)山脈屏障的存在沒有明顯關(guān)系。

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