余繼英，何 林，傅 川，董 蕓，陳 璐，李晉奇，師健友

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，a.藥劑科，b.急診內(nèi)科，四川 成都 610072;2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

氫氯噻嗪屬噻嗪類利尿劑，除利尿作用外，在高血壓治療中也具有重要作用［1］，其降壓機制除減少血容量之外，還可降低外周血管阻力，是抗高血壓復(fù)方制劑中常用的組分［2］，如血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)+噻嗪類利尿劑，是各國高血壓指南推薦的聯(lián)合降壓方案之一［3］。相關(guān)研究也表明ARB+氫氯噻嗪對老年單純收縮期高血壓具有較好的療效［4］。對生物樣本中氫氯噻嗪的測定，文獻報道的有 HPLC-UV 法［5，6］及 HPLC-MS-MS 法［7～9］。本研究參考有關(guān)文獻，利用現(xiàn)有條件，所建立的測定血漿氫氯噻嗪的LC-MS法靈敏準確，可用于人血漿中氫氯噻嗪濃度的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 2695高效液相色譜儀;Waters ZQ質(zhì)譜儀，Waters MassLynx V4.1色譜工作站(美國Waters公司);沙多利斯BP211型電子天平(德國沙多利斯);DIKA?Genius 3漩渦混合器(德國);HC-2517高速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);320R型低溫離心機(德國)。氫氯噻嗪對照品，批號:100309-200702，含量99.8%，中國藥品生物制品檢定所;對乙酰氨基酚對照品(內(nèi)標)，批號:100018-200408，中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 色譜、質(zhì)譜條件 ①色譜條件:色譜柱選用XTerra? MSC18柱(5 μm，2.1 mm×150 mm);保護柱:Diamonsil C18(2)Gartridges(3 μm，2.1 mm×10 mm)，柱溫30℃。流動相:水:乙腈－60:40;流速:0.2 ml/min。進樣量:5μl。②質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(ESI－);選擇離子監(jiān)測(SRM;氫氯噻嗪 m/z 296，錐孔電壓35 V;對乙酰氨基酚 m/z 150，錐孔電壓30 V);毛細管電壓2.5 kV;錐孔電壓40 V;二級錐孔電壓4 V;六級桿透鏡電壓0.4 V;源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流量650 L/H。

1.2.2 溶液配制 精密稱取氫氯噻嗪對照品10.52 mg于10 ml容量瓶，用50%甲醇溶解并定容，得氫氯噻嗪標準品儲備液1(1.05 mg/ml)，－4℃冷藏保存，臨用前用50%甲醇稀釋為系列濃度工作液。精密稱取對乙酰氨基酚10.61 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為1.06 mg/ml的對乙酰氨基酚內(nèi)標儲備液，4℃冷藏保存，臨用前用50%甲醇稀釋為1μg/ml的溶液，即得對乙酰氨基酚內(nèi)標工作液。

1.2.3 樣品預(yù)處理與測定 取血漿樣品0.5 ml，加50%乙腈50μl，再加入25μl內(nèi)標工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，漩渦混勻后，加乙酸乙酯3 ml，漩渦混合2分鐘，于低溫離心機(3000轉(zhuǎn)/分，6℃)離心8分鐘，取上清液于干燥玻璃管中，50℃水浴氮氣揮干，殘渣中加入50%乙腈120μl溶解后，分裝入全自動進樣器，進樣5μl，在設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下測定。記錄氫氯噻嗪和內(nèi)標的色譜峰面積，以氫氯噻嗪峰面積和內(nèi)標的峰面積之比代入當日標準曲線，算出樣品氫氯噻嗪的濃度。

1.2.4 方法學(xué)考察 ①專屬性:在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，取氫氯噻嗪和內(nèi)標對照品溶液、空白血漿及空白血漿加氫氯噻嗪和內(nèi)標樣品經(jīng)預(yù)處理后進樣分析，考察方法的專屬性。②標準曲線及定量下限:取空白血漿0.5 ml共9份，分別加入50μl氫氯噻嗪系列濃度溶液，使血漿氫氯噻嗪為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 和 150 μg/L，按“1.2.3”項下，自“再加入25μl內(nèi)標工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)”起操作。同法制備并測定空白樣品。記錄氫氯噻嗪和內(nèi)標的色譜峰面積，以氫氯噻嗪峰面積和內(nèi)標的峰面積之比對應(yīng)其濃度進行線性回歸，得出氫氯噻嗪血漿標準曲線回歸方程。③方法精密度與準確度:取空白血漿0.5 ml，配制含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10 和 100 μg/L 的質(zhì)控樣品，按“1.2.3”項下，自“再加入25μl內(nèi)標工作液”起操作，以藥物和內(nèi)標的峰面積比在當日標準曲線上求出氫氯噻嗪濃度，每一濃度于同日內(nèi)進行5樣本制備與分析，計算其準確度及批內(nèi)RSD。于不同日連續(xù)測定3批，計算其批間RSD。④提取回收率:取離心管3支，分別加入濃度為10、100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl，各管再加入25μl內(nèi)標工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，50℃水浴氮氣揮干，殘渣以50%乙腈120μl溶解后進樣，記錄色譜圖，所得峰面積記為A1;取空白血漿，配制含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10和100μg/L的質(zhì)控樣品，每種濃度各配制3個樣品，按“1.2.3”項下，自“再加入25 μl內(nèi)標工作液”起操作，進樣并記錄色譜圖，所得峰面積記為A2。以A2/A1×100計算氫氯噻嗪及內(nèi)標對乙酰氨基酚提取回收率。⑤基質(zhì)效應(yīng):取離心管3支，分別加入濃度為10，100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl，各管再加入25μl內(nèi)標工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，50℃水浴氮氣揮干，殘渣以50%乙腈120μl溶解后進樣，記錄色譜圖，所得峰面積記為A1。取空白血漿樣品0.5 ml，加入50%乙腈75μl，乙酸乙酯3 ml，漩渦混合2分鐘，于低溫離心機(3000轉(zhuǎn)/分，6℃)離心8分鐘，取上清液于干燥玻璃管中，50℃水浴氮氣揮干，殘渣以50%乙腈120μl溶解后混勻。同法制備20份，合并作為空白基質(zhì)溶液備用。取離心管，分別加入濃度為10、100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl(每種濃度各5份)，各管再加入25μl內(nèi)標工作液(對乙酰氨基酚，1μg/m l)，50℃水浴氮氣揮干后，分別加入空白基質(zhì)溶液各120μl，混勻后進樣并記錄其色譜峰面積A2;以A2/A1×100計算基質(zhì)效應(yīng)。⑥血樣穩(wěn)定性:分別取在室溫放置4和8 h后、－20℃冷凍后凍融1，2，3 次、－20 ℃保存14、24 和48 天的含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10和100μg/L的血漿樣品，按“1.2.3”項下操作，由當日標準曲線計算氫氯噻嗪濃度，每一濃度測定3份樣品。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察 ①專屬性、標準曲線及定量下限:由圖1～圖3可見，氫氯噻嗪和內(nèi)標的保留時間分別約為2.4 min和2.1 min，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)基本不影響樣品的分離測定;氫氯噻嗪血漿標準曲線回歸方程證明氫氯噻嗪血藥濃度在0.5～150μg/L范圍內(nèi)與峰面積比之間有良好線性關(guān)系。氫氯噻嗪的最低定量限為0.5μg/L。②方法精密度與準確度:見表1。③氫氯噻嗪及內(nèi)標對乙酰氨基酚提取回收率分別為57.0% ～72.8%及(56.3±3.3)%。④基質(zhì)效應(yīng):氫氯噻嗪在1、10和100μg/L三種血漿濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)平均值分別為(93.5±8.1)%、(93.8±6.1)%和(94.5±6.0)%;內(nèi)標對乙酰氨基酚的基質(zhì)效應(yīng)值為(74.6±8.75)%。氫氯噻嗪及內(nèi)標對乙酰氨基酚的基質(zhì)效應(yīng)均可滿足測定要求。⑤血樣穩(wěn)定性:氫氯噻嗪血漿樣品在室溫放置8h、經(jīng)－20℃反復(fù)凍融3次、在－20℃保存48天，氫氯噻嗪濃度無明顯變化。含氫氯噻嗪血漿樣品經(jīng)處理后室溫放置24 h，氫氯噻嗪濃度無明顯變化;氫氯噻嗪儲備液于4℃下保存65天仍然穩(wěn)定，對乙酰氨基酚儲備液于4℃下保存47天仍然穩(wěn)定，均能滿足生物樣品測定要求。

2.2 方法應(yīng)用 本方法應(yīng)用于氯沙坦鉀氫氯噻嗪片生物等效性試驗。試驗方案經(jīng)院倫理委員會批準，志愿者在知情情況下填寫知情同意書。按照試驗方案選擇21名健康男性受試者參加試驗。試驗當日晨給藥前在前臂靜脈安置留置針(可保留至給藥后12小時)，抽取空白血樣4 ml后，分別空腹用200 ml溫水送服氯沙坦鉀氫氯噻嗪試驗制劑和參比制劑62.5mg，并于服藥后0.33、0.67、1、1.33、1.67、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36 和 48 h 各采靜脈血4 ml置于含肝素的試管中，抽取的血樣于2500 rpm離心，分離血漿，置 －20℃的低溫冰箱保存?zhèn)錅y。21例受試者交叉口服試驗制劑和參比制劑后均值血藥濃度－時間曲線見圖4。

圖1 氫氯噻嗪和內(nèi)標對乙酰氨基酚對照品的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)1氫氯噻嗪;2對乙酰氨基酚

圖2 空白血漿的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)

圖3 空白血漿加氫氯噻嗪和內(nèi)標對乙酰氨基酚的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)1氫氯噻嗪;2對乙酰氨基酚

表1 精密度與回收率試驗結(jié)果 (n=15)

圖4 21例健康受試者口服62.5 mg氯沙坦鉀氫氯噻嗪片試驗制劑與參比制劑后氫氯噻嗪的均值藥時曲線

3 討論

氫氯噻嗪的水溶性較強，但僅以甲醇、乙腈進行去蛋白處理后進樣分析，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較大，因此考慮用液-液萃取法對血樣進行預(yù)處理。在對比了乙醚、甲基叔丁基醚、醋酸乙酯及二氯甲烷的提取效果后，發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯提取效率較高，內(nèi)源性雜質(zhì)基本不干擾測定，因此選擇醋酸乙酯為提取溶劑。

氫氯噻嗪在ES-模式下才可電離，在流動相的選擇方面，考慮通過在流動相中加入乙酸銨以得到更高的靈敏度，實驗后發(fā)現(xiàn)，與不加乙酸銨相比，加入乙酸銨后在測定物峰形、靈敏度方面并無明顯改善，因此最終選擇流動相為水:乙腈-60:40。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本試驗所建立的方法專屬性強，靈敏度高，能滿足生物樣品測定的要求。

21名健康受試者口服單劑量氯沙坦鉀氫氯噻嗪片試驗制劑和參比制劑后，氫氯噻嗪主要藥動學(xué)參數(shù)無顯著性差異，體內(nèi)過程與文獻［10］報道基本吻合。

［1］郝玉明，韓永燕.噻嗪類利尿藥在高血壓患者中的應(yīng)用［J］.臨床藥物治療雜志，2012，10(1):4-7.

［2］杜海洲，劉娜，劉桂玲，等.國際抗高血壓復(fù)方制劑研發(fā)進展［J］.中國新藥雜志，2010，19(18):1676-1679.

［3］孫寧玲.血管緊張素受體拮抗劑聯(lián)合利尿劑的治療方案在高血壓治療中的地位［J］.中華高血壓雜志，2010，18(8):712-715.

［4］鄒文淑，陳德助，彭良君，等.國產(chǎn)替米沙坦與苯磺酸左旋氨氯地平聯(lián)合氫氯噻嗪治療老年單純收縮期高血壓的療效及安全性比較［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(5):52-54.

［5］孫瑩瑩，韋陽，王恪申，等.HPLC法測定人血漿中氫氯噻嗪的濃度［J］.藥物分析雜志，2010，30(3):396-398.

［6］胡連棟，邢倩斌，劉慈，等.復(fù)方氫氯噻嗪片在家犬體內(nèi)的藥動學(xué)和相對生物利用度研究［J］.中國藥房，2010，21(1):30-31.

［7］王蓉，楊昆，譚潔.人體氫氯噻嗪血藥濃度測定與藥代動力學(xué)研究［J］.中國藥業(yè)，2011，20(23):17-18.

［8］潘杰，張全英，張逸凡，等.健康受試者口服復(fù)方替米沙坦片后氫氯噻嗪的藥物動力學(xué)［J］.中國藥師，2009，12(5):563-566.

［9］許莉，蔣娟娟，田蕾，等.復(fù)方纈沙坦在健康人體的生物等效性［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27(11):856-870.

［10］劉茜，王鷺，尚宏偉，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中氯沙坦/氫氯噻嗪的濃度及其人體相對生物利用度研究［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2009，25(4):341-345.