那 鍵，馬 超，霍維玲，秦瑞云，許 永，王 濤，吳曉東，谷貴山

（1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，江蘇 徐州 221009；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春 130021）

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠乳鼠40只

（出生48h以內(nèi)），吉林大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 茜素紅（北京中山生物技術(shù)公司），臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（NIKON公司），ELISA酶標(biāo)儀（美國ELx800），β－甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C（美國Sigma公司），堿性磷酸酶免疫組織化學(xué)試劑盒（南京建成生物制品有限公司），Ⅱ型膠原酶和胎牛血清（北京鼎國生物技術(shù)公司），高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）

1.3 顱骨來源成骨細胞分離 將大鼠乳鼠拉頸處死，75%乙醇中浸泡10min，在超凈工作臺中無菌條件下平皿內(nèi)取出顱骨，仔細剔除表面附著軟組織，剔除骨縫之間軟骨，用PBS浸泡沖洗3次，至骨塊發(fā)白透亮，用眼科剪刀將其剪成1mm×1mm×1mm左右碎塊。再加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶，37℃水浴箱內(nèi)置20min，每10min搖晃1次以消化掉纖維組織、成纖維細胞和血細胞，共2次，去除懸液，因為懸液里含有大量消化下來的成纖維細胞。然后再加入2倍體積的Ⅱ型膠原酶消化。在37℃水浴箱中1h，過200目篩網(wǎng)去除碎骨塊，細胞懸液以1 000r·min－1離心5min，收集消化液中的細胞，PBS漂洗后接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。膠原酶消化及提取細胞步驟重復(fù)4次。2～3d換液待細胞近鋪滿全瓶后傳代。

1.4 細胞的傳代培養(yǎng) ①細胞融合后棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次；②用0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）1mL消化細胞，置細胞培養(yǎng)箱中消化2min，顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞變圓、細胞間隙增大時，輕輕振動培養(yǎng)板使細胞脫壁，加入10%胎牛血清終止消化；③用吸管吸取瓶中培養(yǎng)基按一定順序沖洗瓶壁，使全部細胞脫壁形成單細胞懸液，將細胞懸液移入離心管20℃、1 200g離心10min；④棄上清液，加1mL培養(yǎng)基用吸管反復(fù)吹打瓶壁，重懸細胞，血細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為2×105mL－1，取0.1mL細胞懸液移入50mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2濕化空氣的孵箱中進行靜置培養(yǎng)。此為第1代成骨細胞。傳代過程中每2～3d換液1次，直到細胞彼此匯合鋪滿整個培養(yǎng)瓶底，然后按1∶2的量接種培養(yǎng)，為第2代大鼠成骨細胞，依此類推。

1.5 體外培養(yǎng)成骨細胞純化 采用差速黏附的方法來純化細胞：利用成纖維細胞比成骨細胞更易黏附到瓶壁的特點將消化下來含成纖維細胞的懸液接種到培養(yǎng)瓶中，靜置20min左右，輕輕吸取上清液到另一培養(yǎng)瓶中，20min后再將培養(yǎng)液吸出接種于第3個培養(yǎng)瓶中，形成的細胞懸液中即為純化的成骨細胞。每次傳代時均用此法純化成骨細胞。

1.6 大鼠顱骨來源成骨細胞鑒定 ①生長情況和形態(tài)學(xué)觀察：每天觀察培養(yǎng)的原代及傳代大鼠成骨細胞測定其生長情況（MTT法），繪制細胞生長曲線，同時用倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)的變化。傳代細胞以1×104接種于96孔板，每孔加入常規(guī)成骨細胞培養(yǎng)液180μL，每組設(shè)8個重復(fù)孔。每天檢測時間點前4h加 MTT（5g·L－1），20μL/孔，檢測時加DMSO，150μL/孔，酶標(biāo)儀檢測吸光度（A）值（波長為490nm）。繪制細胞生長曲線。②蘇木精染色觀察：取第3代培養(yǎng)的成骨細胞進行蘇木精染色，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定10min，雙蒸水沖洗；加蘇木精染液5min，鹽酸酒精分色，流動自來水沖洗3min，藍化、雙蒸水浸洗5min，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固。③堿性磷酸酶（ALP）染色（改良Kaplow氏法）：成骨細胞可以特異性形成ALP，成骨細胞融合成層后，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的ALP，通過ALP染色可以對細胞進行鑒定。本實驗采用改良Kaplow法染色對所誘導(dǎo)的成骨細胞形成ALP能力進行測定。將第3代細胞接種于有鈣玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞長至形成結(jié)節(jié)后取出，PBS沖洗，甲醛固定液固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次晾干，滴加新鮮配制的底物液蓋滿樣本部分加封口膜，37℃孵育液中15min（現(xiàn)用現(xiàn)配），蒸餾水沖洗數(shù)次，用蘇木素復(fù)染3min，蒸餾水洗數(shù)次晾干。④礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色：該染色法是鑒別成骨細胞的特異性染色法。連續(xù)培養(yǎng)25d的細胞爬片，PBS洗3次，95%乙醇固定10min，水洗后，用飽和茜素紅染色30min，水洗，乙醇脫色，二甲苯透明，樹膠封片后觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細胞的一般形態(tài)學(xué)觀察 剛分離的原代細胞貼壁前是均勻一致的小球形，折光性強，大小不一，細胞周圍有光暈，細胞核偏于一側(cè)，可見清晰的核仁。接種24h后可見部分圓形細胞以散在的方式貼壁，貼壁細胞有小的突起，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞伸出較多突起，有的突起相互連接。48～72h細胞完全貼壁伸展成飽滿多角狀，成多個集落。7～8d時集落迅速增多。至10～15d細胞約進入快速生長期，集落中心細胞密集，周圍細胞呈放射狀或旋渦狀排列，細胞之間無接觸抑制現(xiàn)象，集落間出現(xiàn)重疊，各集落的大小、細胞的疏密程度和細胞排列方式不盡相同。15～20d細胞融合，細胞重疊復(fù)層生長。傳代培養(yǎng)的成骨細胞其形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則多角形，多為不規(guī)則三角形或四邊形，細胞表面有短而薄的突起。蘇木精染色顯示：細胞形態(tài)不規(guī)則，表面有長的突起，細胞之間連接成網(wǎng)狀，細胞核橢圓形，核仁1～2個（圖1，見封三）。

2.2 成骨細胞成骨特性的鑒定 ①ALP染色：經(jīng)ALP染色后，細胞漿為紫黑色，并可見大量紫黑色顆粒。約80%以上的細胞呈陽性（圖2A，見封三）。②礦化結(jié)節(jié)染色：經(jīng)礦化結(jié)節(jié)染色后，可見胞外基質(zhì)中的紅色礦化結(jié)節(jié)（圖2B，見封三）。

2.3 MTT法測定細胞的增殖結(jié)果 第3代細胞生長曲線呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的 “S”型，有明顯的對數(shù)生長期及平臺期，符合成骨細胞生長規(guī)律（圖3）。

圖3 大鼠顱骨來源第3代成骨細胞生長曲線Fig.3 The growth curve of osteoblasts at the 3rd generation from rat skull

3 討 論

成骨細胞在體內(nèi)能合成和分泌膠原、糖蛋白等類骨質(zhì)成分，參與類骨質(zhì)的鈣化過程，是體內(nèi)參與骨形成過程的主要細胞[1]，是體外成骨細胞實驗的主要細胞來源。1974年Birlderraan詳述了成骨細胞分離、培養(yǎng)和初步鑒定方法，此后體外成骨細胞原代培養(yǎng)方法逐漸發(fā)展成型[2]。

目前從骨組織獲取成骨細胞的方法主要有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，酶消化法是將骨組織塊經(jīng)酶消化處理后收集細胞進行培養(yǎng)，一次可獲較多量細胞，是目前較常用方法。有研究證實：骨組織中各種細胞耐受消化酶能力依次為：成纖維細胞＜破骨細胞＜骨祖細胞＜成骨細胞。分步酶消化法可將首次消化獲得的細胞拋棄，以減少首先消化下來的成纖維細胞、破骨細胞、骨祖細胞等的污染，再行消化可收集到較純的成骨細胞。常用的消化酶主要有胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶。由于成骨細胞比較脆弱，故培養(yǎng)難度較大，如何獲得大量優(yōu)質(zhì)的原代來源成骨細胞是一個有挑戰(zhàn)性的難題。本實驗對酶消化法進行改良取得了理想的效果。

本研究中組織來源為出生24～48h內(nèi)雌性大鼠乳鼠顱骨，優(yōu)點是成骨細胞較多，細胞活力強，且骨組織易于處理。取顱骨時應(yīng)注意剔除骨膜及周圍透明軟骨結(jié)節(jié)，以減少雜質(zhì)細胞的污染。為了保證成骨細胞活性，所有操作過程應(yīng)在冰盒上進行。

傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化處理時間為1h甚至更長，Ⅱ型膠原酶過夜消化，實踐證明這種方法容易損傷細胞膜表面受體和抗原成分，細胞成活率低或者細胞功能受損。鑒于此，本實驗對消化的時間及方法進行了改良，視骨組織塊大小靈活掌握消化時間，盡量將胰酶作用時間控制在30min以內(nèi)，如果切成乳糜狀，胰蛋白酶消化時間應(yīng)該小于20min，消化1次即可去除雜質(zhì)細胞，過長時間的消化導(dǎo)致骨組織上的需要的成骨細胞數(shù)量過少且功能受損，二次膠原酶消化后成骨細胞成活率很低往往導(dǎo)致失敗。如果骨塊在1mm×1mm×1mm左右，則胰蛋白酶可以每次消化25～30min，連續(xù)消化2次，以徹底消化去除非目的細胞。有報道稱Ⅱ型膠原酶對細胞無明顯影響，故本實驗初期做膠原酶過夜消化，結(jié)果細胞數(shù)量很多，但成活率很低，很多細胞無法貼壁。本實驗采取的辦法是Ⅱ型膠原酶消化1h，每隔1h收集1次細胞，更換膠原酶繼續(xù)消化1h，獲得大量優(yōu)質(zhì)種子細胞。

獲取的原代細胞最好采用一次性的塑料培養(yǎng)瓶，因其帶有負電荷細胞容易貼壁生長。使用前要預(yù)加入培養(yǎng)液培養(yǎng)1h。細胞接種后可采用差速貼壁法提純成骨細胞。因為成纖維細胞先貼壁，所以傳代后靜置20min時成纖維細胞已經(jīng)貼壁，將仍未貼壁的成骨細胞接種至另一培養(yǎng)瓶。另外每次換液時要輕輕搖晃培養(yǎng)液以倒掉非貼壁的雜質(zhì)細胞。

成骨細胞體外生長大致經(jīng)過快速增殖、細胞外基質(zhì)形成和基質(zhì)礦化3個生長階段。本研究結(jié)果證實：體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞培養(yǎng)約6～7d后細胞完全貼壁進入快速增殖期；當(dāng)細胞生長至單層融合狀態(tài)時分裂速度減慢，不傳代細胞成集落分層生長，Ⅰ型膠原等骨基質(zhì)成分分泌活躍，3～5周時終基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)形成。Sudo等[3]報道：體外培養(yǎng)條件下成骨細胞可產(chǎn)生特異性鈣化，這是鑒定成骨細胞的重要依據(jù)，體外培養(yǎng)的成骨細胞在有維生素C和β－甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)生長時，促進了鈣鹽沉積[4]，有利于礦化結(jié)節(jié)形成。

對于成骨細胞分化成熟的調(diào)節(jié)是目前國內(nèi)外研究的熱點，已經(jīng)明確的因素包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）[5]、細胞生長因子、激素和機械物理等。最新研究[6－7]表明：微孔鈦絲可以誘導(dǎo)成骨細胞分化及成熟，Wnt5a蛋白可以增加BMP2、BMP4和BMP7表達，進而促進成骨細胞分化及成熟，氨基丁酸可以通過下調(diào)BMP2及RANKL表達誘導(dǎo)成骨細胞向破骨細胞分化而減少成骨細胞分化及成熟[8]。鈣離子和硅酸根離子[9]、13－93玻璃纖維[10]及聚磷腈[11]在體內(nèi)外對成骨細胞分化成熟均可起正向調(diào)控作用。

本實驗可獲得純度較高的體外培養(yǎng)成骨細胞，并且具有典型成骨細胞的生物學(xué)特征，本研究為體外原代培養(yǎng)成骨細胞提供一種合理、有效的方法。

[1]丁煥文，何錫煌，蘇增貴.新生小鼠成骨細胞體外培養(yǎng)及其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 [J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1998，23（6）：449-451.

[2]薛燕濰，李鋒杰，王亦進，等.成骨細胞培養(yǎng)方法的改良 [J].解剖科學(xué)進展，2005，11（1）：82.

[3]Sudo H， Kodama HA， Amagai Y，et al.Invitrodifferentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria [J].J Cell Biol，1983，96（1）：191-198.

[4]Barnes MJ.Function of ascorbic acid in collagen metabolism [J].Ann NY Acad Sci，1975，282（2）：264-277.

[5]Centrelia M， Horowitz MC， Wozney JM， et al.Transforming growth factor-b gene family members and bone [J].Endocr Rev，1994，15（1）：27-39.

[6]Olivares-Navarrete R，Hyzy SL，Hutton DL，et al.Role of non-canonical Wnt signaling in osteoblast maturation on microstructured titanium surfaces [J].Acta Biomater，2011，7（6）：2740-2750.

[7]Olivares-Navarrete R，Gittens RA，Schneider JM，et al.Osteoblasts exhibit a more differentiated phenotype and increased bone morphogenetic protein production on titanium alloy substrates than on poly-ether-ether-ketone [J].Spine J，2012，12（3）：265-272.

[8]Takahata Y，Takarada T，Hinoi E，et al.Osteoblastic γ-aminobutyric acid，type B receptors negatively regulate osteoblastogenesis toward disturbance of osteoclastogenesis mediated by receptor activator of nuclear factor KB ligand in mouse bone [J].J Biol Chem，2011，286（38）：32906-32917.

[9]Kasuga T，Obata A，Maeda H，et al.Siloxane-poly（lactic acid）-vaterite composites with 3Dcotton-like structure [J].J Mater Sci Mater Med，2012，23（10）：2349-2357.

[10]Modglin VC，Brown RF，F(xiàn)u Q，et al.Invitroperformance of 13-93bioactive glass fiber and trabecular scaffolds with MLO-A5osteogenic cells [J].J Biomed Mater Res A，2012，100（10）：2593-2601.