周精華，揭雨成，2* ，杜曉華，邢虎成，2，熊力夫

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，長(zhǎng)沙410128;2湖南省種質(zhì)資源創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128;3長(zhǎng)沙市葛根工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410005)

葛(Pueraria DC)又名葛藤、葛麻葉、甜葛藤、粉葛藤等，是豆科碟形花亞科菜豆族(Phaseolease)多年生纏繞藤本植物［1］。世界上有葛20余種，我國(guó)是葛屬植物的分布中心，大約有12種，其中可入藥的有8種。野葛是產(chǎn)量最高、使用最廣的品種，除西藏、青海、新疆外，其它省區(qū)均有分布，粉葛則主要產(chǎn)于廣西、廣東，以栽培為主［2，3］。葛根是我國(guó)醫(yī)療保健的良方妙藥，多部醫(yī)藥著作均有記載其性味功能和醫(yī)療保健作用，其主要藥用成分為黃酮類物質(zhì)，是一種開(kāi)發(fā)前景廣闊的藥用植物［4～6］。但是由于其產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等因素的影響，不同葛種質(zhì)資源中所含的有效成分差異較大，加上我國(guó)葛種質(zhì)資源分布廣泛，種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系不清楚，給葛的研究開(kāi)發(fā)和利用帶來(lái)很大困難［7］。采用RAPD分子標(biāo)記研究葛種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，對(duì)葛種質(zhì)資源的遺傳育種、研究開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑和材料

基因組提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN，Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)購(gòu)自 TaKaRa公司，GeneRuler 1 kb DNA Ladder購(gòu)自Fermentas公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。8份葛材料來(lái)自湖南和江西等地，由于采樣關(guān)系，沒(méi)有記錄相應(yīng)的表型數(shù)據(jù)。葛樣品的編號(hào)和名稱見(jiàn)表1。

表1 8份葛材料的名稱及來(lái)源Table 1 The name and origins of 8 arrowroots

1.2 試驗(yàn)方法

采用TIANGEN的基因組提取試劑盒提取葛的葉片的基因組DNA。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，用無(wú)菌水將DNA稀釋至20 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和檢測(cè)

參考已有文獻(xiàn)中的 RAPD 反應(yīng)體系［8～11］，對(duì)RAPD的影響因素如引物濃度、模板DNA濃度、退火溫度等進(jìn)行梯度試驗(yàn)，獲得最適RAPD反應(yīng)條件。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)體系采用20 μL的反應(yīng)體系，其中包含20 ng的 DNA 1 μL，20 mmol/L 的引物1 μL，2×Premix Taq Version2.0(dNTP each 0.4 mmol/L，Mg2+0.3 mmol/L，TaKaRa Taq 0.5 U)10 μL 和ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，37℃ 30 s，72℃ 90 s，40 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min，取8 μL PCR產(chǎn)物于含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè);電泳緩沖液為1×TBE，在100 V電壓下電泳50 min后用柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.4 引物篩選

選用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的100條隨機(jī)引物，隨機(jī)抽取3個(gè)樣品對(duì)100條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選;選出擴(kuò)增條帶數(shù)量多、條帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的隨機(jī)引物10條用于全部葛種質(zhì)資源的擴(kuò)增和RAPD分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擴(kuò)增產(chǎn)物在相同遷移位置有條帶賦值為1，無(wú)條帶賦值為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYS－PC 2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD標(biāo)記的多態(tài)性分析

采用100個(gè)隨機(jī)引物對(duì)隨機(jī)抽取的3份葛種質(zhì)資源DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出具有多態(tài)性且擴(kuò)增條帶清晰的隨機(jī)引物10條。10條多態(tài)性較好的引物對(duì)8份葛材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在200～3 000 bp，共擴(kuò)增出99條帶，其中多態(tài)性條帶65條，多態(tài)性程度為65.65%。其中引物S82和S172的多態(tài)性位點(diǎn)較多，分別為83.33%和88.88%(圖1和表2)。

圖1 S82和S172引物的RAPD擴(kuò)增Fig.1 Amplification of RAPD with S82 and S172 primers

表2 RAPD引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The sequences and amplification results of RAPD primers

(續(xù)表2)

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

利用NTSYS－PC 2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)RAPD擴(kuò)增所得多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)8份葛材料的遺傳相似系數(shù)在0.626～0.939之間(表3)，其中E3與其他材料的遺傳相似性在0.626～0.767之間，說(shuō)明E3與其他材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);E7和E8的遺傳相似系數(shù)為0.939，即兩者之間的親緣關(guān)系最近。

表3 8份葛材料的遺傳相似系數(shù)Table 3 Genetic similarity coefficient of 8 arrowroot varieties

2.3 聚類分析

采用UPGMA法構(gòu)建葛種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)，在遺傳系數(shù)為0.740時(shí)，可將8份葛材料分為4類，第1類只含1份材料E3，來(lái)源于湖南漢壽的選育品種，農(nóng)藝性狀較好，和其他材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以進(jìn)行雜交育種，具有很大的利用價(jià)值;第2類也只含有1份材料E6，是湖南桃江的一個(gè)栽培品種;第3類包含2份材料E4和E5，均來(lái)自江西;第4類包括4個(gè)品種 E1、E2、E7和E8，其中 E1和E2是湖南漢壽選出的兩個(gè)重要栽培品種，農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀均較好，E7和E8是來(lái)自湖南桃江的2個(gè)野生材料，親緣關(guān)系較近。從聚類結(jié)果看，葛材料所屬類群與地理來(lái)源有關(guān)。

圖2 8份葛材料聚類分析圖Fig.2 The clustering analysis of 8 arrowroot varieties

3 討論

RAPD分子標(biāo)記具有數(shù)量多，顯性或者共顯性、簡(jiǎn)單易行、無(wú)需明確知道基因的序列等特點(diǎn)［12］，被廣泛應(yīng)用于各種植物的遺傳多樣性分析和品種鑒別等方面［13，14］。但是由于RAPD－PCR影響的因素太多，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，如模板的濃度太高會(huì)增加非特異性條帶的擴(kuò)增，而模板濃度太低又會(huì)影響PCR的擴(kuò)增，甚至使PCR擴(kuò)增失敗;退火溫度影響引物與模板之間的結(jié)合，退火溫度過(guò)高，引物與模板結(jié)合的位點(diǎn)變少，使擴(kuò)增條帶減少，退火溫度過(guò)低，易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，甚至產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，影響讀帶等等;還有Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq的量等也影響 RAPD 的 結(jié) 果［9，11，15～18］。因 此，往 往 需 要 對(duì)RAPD的條件進(jìn)行優(yōu)化，本研究?jī)?yōu)化了RAPD－PCR的退火溫度、模板濃度和引物濃度，發(fā)現(xiàn)退火溫度為37℃，模板濃度為20 ng，引物的終濃度為1 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶最多，條帶最清晰。

從DNA分子水平來(lái)說(shuō)，遺傳距離的變幅越大，說(shuō)明其遺傳分化越大，遺傳多樣性高，表明遺傳背景復(fù)雜及該物種存在歷史長(zhǎng)遠(yuǎn)。景戌等人對(duì)重慶地區(qū)葛遺傳多樣性進(jìn)行RAPD分析表明，12個(gè)隨機(jī)引物共檢測(cè)出109條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)占64.41%，36份葛種質(zhì)資源的遺傳距離在0.000～0.360之間，葛種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)按類平均法，可聚為3類［19］。本研究中10個(gè)多態(tài)性較好的隨機(jī)引物共檢測(cè)出99條帶，多態(tài)性位點(diǎn)占65.65%，與景戌等人研究的多態(tài)性比例接近。本研究中的8份葛材料的遺傳相似系數(shù)最大的為0.939，最小為0.626，表明葛在遺傳進(jìn)化過(guò)程中，隨著時(shí)間和空間的變化，其基因組發(fā)生了很大的變化，從而構(gòu)成了豐富的葛種質(zhì)資源庫(kù)，這為葛遺傳育種和品種改良提供了良好的基礎(chǔ)。

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