梁舉春，嚴(yán) 冬

(1.西藏天知生物科技開發(fā)有限公司，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)(成都)科技孵化園，四川 成都 610000)

冬蟲夏草體外溶出度研究

梁舉春1，嚴(yán) 冬2

(1.西藏天知生物科技開發(fā)有限公司，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)(成都)科技孵化園，四川 成都 610000)

依據(jù)《藥典》中的溶出度測定法進(jìn)行冬蟲夏草納米粉膠囊、冬蟲夏草粗粉膠囊及冬蟲夏草藥材的體外溶出實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)顯示，冬蟲夏草藥材在10 min時(shí)溶出最多，冬蟲夏草納米粉膠囊及冬蟲夏草粗粉膠囊都在40 min時(shí)達(dá)到溶出最高點(diǎn)，而納米粉溶出度高達(dá)100%.結(jié)果表明，裝入膠囊的冬蟲夏草粉比未裝入膠囊的冬蟲夏草藥材，溶出度穩(wěn)定，且冬蟲夏草納米粉溶出度最高.

冬蟲夏草；體外；溶出度

0 引 言

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體.夏初子座出土、孢子未發(fā)散時(shí)挖取，曬至六七成干，除去類似纖維狀的附著物及雜質(zhì)，曬干或低溫干燥后即成.冬蟲夏草具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效，臨床常用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血等癥.本研究考察了冬蟲夏草納米粉膠囊、粗粉膠囊及冬蟲夏草藥材的溶出度，擬為最大化利用該傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥材提供藥學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括，ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)儀器廠)，HP1100高效液相色譜儀(安捷倫公司)，Mettler-AB204電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.2 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材包括，腺苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號，110879-200202，供含量測定用)，冬蟲夏草納米粉膠囊(0.3 g/粒)、冬蟲夏草粗粉膠囊(0.3 g/粒)及冬蟲夏草藥材均由西藏天知生物科技開發(fā)有限公司提供(批號，100101).實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為合格可用.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括，磷酸和甲醇為色譜純、三蒸水(自制)，其他試劑均為分析純.

2 方 法

2.1 冬蟲夏草腺苷含量測定方法的建立

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn).

1)對照品溶液的制備.精密稱取腺苷1.4 mg，置10mL量瓶中，用90%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取溶液1 mL，置5 mL量瓶中，加 90%甲醇至刻度，搖勻，即得.

2)供試品溶液的制備.精密稱定冬蟲夏草粉末0.5 g共3份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45 μ m 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得.

3)高效液相色譜柱溫度的確定.參照《藥典》2010年版(一部)冬蟲夏草含量測定項(xiàng)下的方法[1]，分別于色譜柱溫度為30、35、40℃時(shí)進(jìn)樣，進(jìn)樣量各10 μ L，考察色譜柱溫度變化對腺苷含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果如表1所示.

從表1可以看出，色譜柱溫度影響出峰時(shí)間，對峰面積影響較小，結(jié)合液相色譜圖峰形綜合考慮，選定液相色譜柱溫度為35℃.

4)液相色譜流動(dòng)相流速的確定.參照《藥典》2010年版(一部)冬蟲夏草含量測定項(xiàng)下的方法[1]，分別于液相色譜流動(dòng)相流速為0.8、1.0、1.2 mL/min時(shí)進(jìn)樣，進(jìn)樣量各為10 μ L，考察流動(dòng)相流速變化對腺苷含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果如表2所示.

表1 色譜柱溫度變化對腺苷含量測定結(jié)果的影響

表2 流動(dòng)相流速變化對腺苷含量測定結(jié)果的影響

從表2可以看出，隨著流動(dòng)相流速的增大，出峰時(shí)間與峰面積減小，但對測定結(jié)果腺苷的含量無明顯影響，確定流動(dòng)相的流速為1.0 mL/min.

綜上，確定腺苷含量測定色譜柱溫度為35℃、流動(dòng)相流速為1.0 mL/min.

2.1.2 線性關(guān)系考察.

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(pH6.5))～甲醇(85∶15)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，色譜柱溫度35℃，檢測波長為260 nm.分別精密吸取28 μ g/mL 腺苷對照品溶液 4 、6 、8、10、12、14 μ L 注入液相色譜儀進(jìn)行測定.以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量為縱坐標(biāo)圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，得線性回歸方程，

由圖 1可見，進(jìn)樣量在 0.112～0.392 μ g范圍內(nèi)，線性良好.

圖1 腺苷線性關(guān)系圖

2.1.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn).

精密稱定冬蟲夏草粉末1.05 g共3份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入 90%甲醇20 mL，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流 30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為已知濃度供試品溶液.

分別精密吸取3份提取液2mL，精密加入28 μ g/mL腺苷對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，以90%甲醇補(bǔ)足4 mL，搖勻，以0.45 μ m 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別作為準(zhǔn)確度試驗(yàn)低、中、高濃度供試品溶液.

按照2.1.2項(xiàng)下的方法，分別吸取上述溶液各10 μ L，注入液相色譜儀，平均回收率為 104.01%，RSD為1.70，結(jié)果如表3所示.

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn).

精密稱定冬蟲夏草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入 90%甲醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液.按照2.1.2項(xiàng)下的方法，吸取上述溶液10 μ L，注入液相色譜儀，平行6份測定，結(jié)果如表4所示.

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好.

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn).

精密稱定冬蟲夏草粉末0.5 g共3份，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液.按照2.1.2項(xiàng)下的方法，吸取上述溶液 10 μ L，注入液相色譜儀，在不同時(shí)間測定，結(jié)果如表5所示.

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

綜上，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(pH6.5))～甲醇(85∶15)為流動(dòng)相，檢測波長為260 nm，測定冬蟲夏草中腺苷的方法準(zhǔn)確高效.

2.2 冬蟲夏草體外溶出度測定

2.2.1 供試品制備.

冬蟲夏草納米粉膠囊，藥材粉碎成納米粉，過300目篩，裝入膠囊(0.3 g/粒)，每杯 15粒；冬蟲夏草粗粉膠囊，藥材粉碎，過5號篩(80目)，裝入膠囊(0.3 g/粒)，每杯15粒；冬蟲夏草藥材，取原藥材，每一杯約4.0 g.

2.2.2 體外溶出度測定方法.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn).以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(pH6.5))～甲醇(85∶15)為流動(dòng)相，檢測波長為260 nm，理論板數(shù)按腺苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000.

2)對照品溶液的制備.精密稱取腺苷約1.4 mg，置10mL量瓶中，用90%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取溶液1 mL，置 5 mL量瓶中，加 90%甲醇至刻度 ，搖勻，即得 28 μ g/mL.

3)供試品溶液的制備.取冬蟲夏草納米粉膠囊、粗粉膠囊及原生藥材，依照溶出度測定法[2]，以450 mL鹽酸緩沖液為溶出介質(zhì)，溫度為37℃±0.5℃，轉(zhuǎn)速為 100 r/min 依法操作 ，于 10 、20、30、40、50、60、70、80 min分別取樣10 mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積溶出介質(zhì).樣品液經(jīng)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得.

4)測定法.分別精密吸取對照品溶液10 μ L與供試品溶液 10～ 20 μ L，注入液相色譜儀，測定，即得.

3 結(jié) 果

3.1 冬蟲夏草納米粉膠囊溶出度測定結(jié)果

冬蟲夏草納米粉膠囊溶出度測定結(jié)果見表6.

表6 冬蟲夏草納米粉溶出度/%

根據(jù)表6數(shù)據(jù)制出冬蟲夏草納米粉膠囊溶出度曲線如圖2、3所示.

圖2 冬蟲夏草納米粉膠囊溶出度曲線

圖3 冬蟲夏草納米粉膠囊平均溶出度曲線

由表6及圖2、3可知，冬蟲夏草納米粉膠囊在前10 min，溶出非常少，到達(dá)20 min時(shí)，大量溶出，溶出度高達(dá)97%，隨著時(shí)間推移，藥粉繼續(xù)溶出，在40 min的時(shí)候到達(dá)溶出最高點(diǎn)，且溶出度基本達(dá)到100%.

3.2 冬蟲夏草粗粉膠囊溶出度測定結(jié)果

冬蟲夏草粗粉膠囊溶出度測定結(jié)果見表7.

表7 冬蟲夏草粗粉膠囊溶出度/%

根據(jù)表7數(shù)據(jù)制出冬蟲夏草粗粉膠囊溶出度曲線如圖4、5所示.

圖4 冬蟲夏草粗粉膠囊溶出度曲線

圖5 冬蟲夏草粗粉膠囊平均溶出度曲線

由表7及圖4、5可知，冬蟲夏草粗粉膠囊在10 min時(shí)，部分溶出，溶出度為40%左右，隨時(shí)間推移，粗粉繼續(xù)溶出，在40 min處到達(dá)溶出最高點(diǎn)，溶出度為73%，未完全溶出.

3.3 冬蟲夏草藥材溶出度測定結(jié)果

冬蟲夏草藥材溶出度測定結(jié)果見表8.

表8 冬蟲夏草藥材溶出度/%

根據(jù)表8數(shù)據(jù)制出冬蟲夏草藥材溶出度曲線如圖6、7所示.

圖6 冬蟲夏草藥材溶出度曲線

圖7 冬蟲夏草藥材平均溶出度曲線

由表8及圖6、7可知，藥材溶出無明顯規(guī)律，溶出度升高，降低，又升高.分析造成這一狀況的原因，可能是因?yàn)樗幉娜硬痪?

溶出后的冬蟲夏草藥材，繼續(xù)置于溶出杯中，保持溶質(zhì)溫度37.5℃，放置過夜.取樣，濾過，取濾液，用高效液相色譜法測定腺苷含量并計(jì)算溶出度，結(jié)果如表9所示.

表9 放置過夜后冬蟲夏草藥材溶出度/%

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，放置一夜后，藥材溶出度升高，有效成分幾乎完全溶出.

4 討 論

1)有研究報(bào)道，冬蟲夏草具有很強(qiáng)的細(xì)胞免疫功能，以及抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗菌等功能[3].據(jù)統(tǒng)計(jì)，野生冬蟲夏草含粗蛋白29.1%～33%，粗脂肪 8.62%，總糖 13.94%～24.20%，粗纖維 18.5%，水分 10.8%，灰分 8.64%[4].此外，冬蟲夏草中還含有氨基酸、脂肪酸、核苷類物質(zhì)、甾醇、甘露醇、多糖等，這些成分是冬蟲夏草發(fā)揮生理活性或藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中核苷類物質(zhì)中的腺苷是冬蟲夏草最重要的活性物質(zhì)之一[5].故本研究以腺苷為指標(biāo)成分測定冬蟲夏草的體外溶出度.

2)冬蟲夏草納米粉膠囊、冬蟲夏草粗粉膠囊及冬蟲夏草藥材3者平均溶出度如表10所示.

表10 3者平均溶出度(%)

根據(jù)表10制出3者平均溶出度曲線如圖8所示.

圖8 3者平均溶出度曲線

由圖8可知，未裝入膠囊的藥材因沒有膠囊殼的溶解在10 min時(shí)溶出最多，裝入膠囊的冬蟲夏草粉都在40 min時(shí)達(dá)到溶出最高點(diǎn)，而納米粉溶出度高達(dá)100%.總的來看，裝入膠囊的冬蟲夏草粉比未裝入膠囊、直接整根溶出的冬蟲夏草藥材，溶出更充分，溶出度更穩(wěn)定.

3)藥物經(jīng)納米級粉碎機(jī)的高速振蕩、研磨后可達(dá)300目的粉末，其細(xì)胞破壁率達(dá)100%以上，最細(xì)粒度可達(dá)100 nm，粉末粒度80%集中在100～500 nm之間.藥物的吸收利用度常常受到吸收部位藥物溶出速度的支配，納米粒徑的藥物由于大的比表面積，增加了其暴露于介質(zhì)中的表面積，促進(jìn)了藥物的溶解，因而可以提高藥物的吸收度，納米粒徑的藥物更容易穿透組織間隙，分布極廣，也可以大大提高其生物利用度[6].冬蟲夏草是我國特有的珍稀名貴中藥材，素有“軟黃金”之稱[7]，經(jīng)納米粉碎后，可提高藥材利用率，從而節(jié)約保貴的藥材資源.

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[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[3]Koh J H ，Yu K W，Suh H J，et al.Activation of macrophagesand the intestinal immune system by an orally adminis-tered decoction from cultured mycelia of cordyceps sinen-sis[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66:407-411.

[4]王尊生，顧宇翔，周麗，等.冬蟲夏草菌絲體固體發(fā)酵粉化學(xué)成分的分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(3):331-336.

[5]劉高強(qiáng)，王曉玲，楊青，等.冬蟲夏草化學(xué)成分及其藥理活性的研究[J].食品科技，2007，(1):202-209.

[6]馬應(yīng)龍，李淑紅.納米中藥的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007 ，13(9):192-194.

[7]秦松云，趙紀(jì)峰，劉翔等.冬蟲夏草市場現(xiàn)狀調(diào)查及對策[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011 ，22(5):1236-1237.

Study on Dissolution of Cordyceps Sinensis in Vitro

LIANGJuchun1，YAN Dong2

(1.Tibetan Tian Zhi Biological Science and Technology Development Co.，Ltd.，Lhasa 850000，China；2.Tibet Autonomous Region(Chengdu)Technology Incubation Park，Chengdu 610000，China)

According to the dissolution testing method of chinese medicines，dissolution experiment in vitro was done with cordyceps nano powder capsules，cordyceps sinensis coarse powder capsules and cordyceps sinensis herbs.The dissolution of cordyceps sinensis herbs was up to maximum at 10 minutes.Cordyceps nano powder capsules and cordyceps sinensis coarse powder capsules achieved the dissolution to the highest point at 40 minuteswhile the Nano powder dissolution was up to 100%.The experimental results show that the dissolution of cordyceps sinensis powder into capsules is more stable than that of cordyceps sinensis herbs which are not loaded into capsules and the dissolution of Cordyceps sinensis nano powder capsules is the highest.

cordyceps sinensis；in vitro ；dissolution

R284.1

A

1004-5422(2013)01-0015-05

2013-01-15.

梁舉春(1973—)，男，高級工程師，從事中藥藥品與保健食品研究.