劉艷萍 朱延林 馬永濤 張江濤 翟曉巧 羅曉雅

(河南省林業(yè)科學(xué)研究院，鄭州，450008)

紫玉蘭(Magnolia liliflora Desr.)屬木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia L.)，花色呈紫色或紫紅色，十分嬌艷;無(wú)論花蕾或盛開(kāi)的花朵，其形狀優(yōu)美;3—4月開(kāi)花，先花后葉，點(diǎn)綴了殘冬的景象。廣玉蘭(Magnolia grandiflora L.)屬木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia L.)，5—6月開(kāi)花，花大如荷花，是優(yōu)良的城市綠化及園林觀賞樹(shù)種，但其花色為白色，較為單調(diào)。將廣玉蘭花粉與紫玉蘭花粉進(jìn)行雜交，以期獲得彩色的廣玉蘭花朵。二者花期不遇是雜交授粉工作的制約因素，希望通過(guò)有效地花粉貯藏解決這一問(wèn)題。因此，如何對(duì)花粉進(jìn)行有效貯藏成為雜交育種和人工輔助授粉中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。前人關(guān)于花粉的研究多集中在不同貯藏條件與萌發(fā)率的關(guān)系[1－3]。有研究表明:花粉進(jìn)入成熟期，內(nèi)部發(fā)生一系列的生理生化代謝反應(yīng)，活力逐漸下降，而花粉中的保護(hù)酶類能夠清除氧自由基，延緩衰老，因此，保護(hù)酶活性的高低能夠直接反映花粉的活力[4－5]。筆者研究了不同貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)紫玉蘭花粉保護(hù)酶活性和花粉生活力的影響，旨在花粉的酶活性方面對(duì)花粉貯藏期間生理生化反應(yīng)進(jìn)行探索，為紫玉蘭花粉的有效貯藏提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

花粉采自河南鄢陵縣某苗木基地內(nèi)的10年生紫玉蘭植株。于2012年4月6日采集樹(shù)冠外圍中部含苞待放的花蕾，帶回后及時(shí)在室內(nèi)摘下花藥放于硫酸紙上，置于室內(nèi)干燥2～3 d，待花粉散出后收集于2.5或5 mL離心管里備用。

花粉的貯藏:本試驗(yàn)分室溫(變色硅膠內(nèi))、4、－20和 －70℃ 4種貯藏溫度;0、10、20、30和40 d 5種貯藏時(shí)間。將處理好的花粉分成4份，每份7瓶，共28瓶，分別放在室內(nèi)盛有變色硅膠的干燥器(室溫)、冰箱冷藏室(4℃)、冰箱冷凍室(－20℃)和超低溫冰箱(－70℃)內(nèi)。達(dá)到設(shè)定貯藏時(shí)間時(shí)從4種溫度下各取出1瓶花粉，取出少量用于花粉生活力測(cè)定，余下花粉取一定量測(cè)定酶活性。

花粉萌發(fā)率測(cè)定:采用液體培養(yǎng)基法，培養(yǎng)基為100 g·L－1蔗糖 +150 mg·L－1H3BO3+200 mg·L－1CaCl2·2H2O，pH 值5.8。培養(yǎng)條件為室溫培養(yǎng)5 h。利用XSP－BM－2CA型生物顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品取5個(gè)視野，每視野約100?；ǚ?，花粉管伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度大于花粉粒直徑時(shí)為具生活力花粉，計(jì)算萌發(fā)率，萌發(fā)率=(具生活力的花粉數(shù)/總花粉數(shù))×100%。

花粉酶活性測(cè)定:(1)酶液的提取。稱取花粉約 0.5000 g 于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值7.0)、適量的PVP和石英砂研磨30 s，于10000 r冷凍離心機(jī)里離心20 min，上清液即為酶液[6]。(2)過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定。反應(yīng)液為4 mL 0.3%愈創(chuàng)木酚 +50 μL 0.3%H2O2，酶液 50 μL，以 0.3% 愈創(chuàng)木酚 +0.3%H2O2作為空白，混合后搖勻靜置1 min，在TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè)定OD470值，每1 min讀數(shù)1次，共讀數(shù)5次。POD酶活性單位為 mg·g－1·min－1[7]。(3)過(guò)氧化氫酶(CAT) 活性測(cè)定。反應(yīng)液為3 mL 0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值7.0)+200 μL 0.3%H2O2，酶液 50 μL，以 3 mL 0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值 7.0)+200 μL 0.3%H2O2作為空白，混合液充分搖勻后靜置1 min，在TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè)定OD240值，每1 min讀數(shù)1次，共讀數(shù)5次。CAT酶活性單位為mg·g－1·min－1[7]。(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定。取0.1 mL酶液加入試管中，再取2支對(duì)照管，分別加入0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值 7.8)3.1 mL、130 mmol·L－1甲硫氨酸 0.2 mL、750 μmol·L－1氮藍(lán)四唑溶液 0.2 mL、100 μmol·L－1乙二胺四乙酸二鈉溶液 0.2 mL 和 20 μmol·L－1核黃素溶液0.2 mL，混勻后將1支對(duì)照管置于暗處，其他各試管于4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，以不照光的對(duì)照管作為空白，分別測(cè)定560 nm波長(zhǎng)下的吸光值，SOD 酶活性單位 U·g－1[7]。以上指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏條件對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

不同貯藏時(shí)間和貯藏溫度條件下，紫玉蘭花粉萌發(fā)率及方差分析結(jié)果如表1所示。方差分析結(jié)果表明，貯藏時(shí)間和貯藏溫度對(duì)花粉萌發(fā)率影響極顯著(P＜0.01)。由表1可以看出，花粉萌發(fā)率下降最快的時(shí)期分別為室溫10～30 d、室溫條件下貯藏至40 d時(shí)花粉幾乎無(wú)生活力，4℃的20～40 d，－20℃的30～40 d，－70℃的40 d。－20和－70℃條件下貯藏40 d的紫玉蘭花粉萌發(fā)率仍有19%和38%，此時(shí)正值廣玉蘭的盛花期，為雜交育種的較佳時(shí)期。

表1 不同貯藏條件下花粉萌發(fā)率多重比較 %

2.2 貯藏條件對(duì)花粉保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 對(duì)花粉過(guò)氧化物酶活性的影響

不同貯藏條件下，紫玉蘭花粉的過(guò)氧化物酶活性變化情況見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果表明貯藏時(shí)間和貯藏溫度對(duì)過(guò)氧化物酶活性有顯著影響(P＜0.05)。由表2可知，室溫條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，紫玉蘭花粉的過(guò)氧化物酶活性呈下降趨勢(shì)，尤其是保存至20 d時(shí)，過(guò)氧化物酶活性急劇降低，降至原來(lái)的38.5%，繼續(xù)延長(zhǎng)保存時(shí)間，過(guò)氧化物酶活性繼續(xù)降低，但其下降速度較慢，30和40 d時(shí)分別為原來(lái)的25.2%和14.4%;4℃條件下，紫玉蘭花粉的過(guò)氧化物酶活性呈升高—下降的變化趨勢(shì)，最高峰出現(xiàn)在10 d時(shí)，之后POD活性開(kāi)始降低，但降低的幅度較小，到40 d時(shí)，POD活性急劇下降，降至0.13 mg·g－1·min－1，為原來(lái)的 23.9%; －20 ℃貯藏條件下，過(guò)氧化物酶活性呈升高—下降的趨勢(shì)，最高峰出現(xiàn)在20 d，此時(shí)過(guò)氧化物酶活性為原來(lái)的1.29倍，之后過(guò)氧化物酶活性緩慢下降，40 d時(shí)過(guò)氧化物酶活性為原來(lái)的73.5%;－70℃貯藏條件下，過(guò)氧化物酶活性呈升高—下降的變化趨勢(shì)，但其變化曲線起伏較小，保存至40 d時(shí)過(guò)氧化物酶活性仍為原來(lái)的96.1%，保持較高的活性。

表2 貯藏條件對(duì)紫玉蘭花粉保護(hù)酶活性的影響

2.2.2 對(duì)花粉過(guò)氧化氫酶活性的影響

不同貯藏條件下，紫玉蘭花粉的過(guò)氧化氫酶活性變化情況如表2所示，方差分析結(jié)果表明貯藏溫度對(duì)過(guò)氧化氫酶活性有顯著影響(P＜0.05)，而貯藏時(shí)間的影響不顯著。表2表明，室溫條件下，在整個(gè)貯藏期間內(nèi)紫玉蘭花粉的過(guò)氧化氫酶活性呈下降趨勢(shì)，保存至40 d時(shí)，過(guò)氧化氫酶活性下降至原來(lái)的19.7%;4℃條件下，紫玉蘭花粉的CAT活性呈下降—升高—下降的變化趨勢(shì)，高低起伏較大，最高峰出現(xiàn)在20 d時(shí)，為原來(lái)的1.38倍，之后過(guò)氧化氫酶活性快速下降，到40 d時(shí)，降至12.4%，為原來(lái)的24.8%;－20和－70℃貯藏條件下，過(guò)氧化氫酶活性的變化規(guī)律一致，均呈下降—升高的趨勢(shì)，且其變化幅度也較小，最高峰均出現(xiàn)在40 d時(shí)，分別達(dá)到 0.65 和 0.74 mg·g－1·min－1，為原來(lái) CAT 活性的 1.30 倍和1.48 倍。

2.2.3 對(duì)花粉超氧化物歧化酶活性的影響

不同貯藏條件下，紫玉蘭花粉的超氧化物歧化酶活性變化情況見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果表明貯藏時(shí)間和貯藏溫度對(duì)超氧化物歧化酶活性有顯著影響(P＜0.05)。室溫條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，紫玉蘭花粉的超氧化物歧化酶活性呈下降趨勢(shì)，保存至40d時(shí)，超氧化物歧化酶活性僅為原來(lái)的37.5%;4℃條件下，紫玉蘭花粉的超氧化物歧化酶活性呈下降—升高—下降的變化趨勢(shì)，高低起伏變化較大，最高峰出現(xiàn)在30 d，最低峰出現(xiàn)在40 d，且最高峰為最低峰的2.60倍;－20℃貯藏條件下，超氧化物歧化酶活性呈下降的變化趨勢(shì)，但下降的幅度較室溫條件下的小很多，40 d時(shí)SOD活性為原來(lái)的50.6%;－70℃條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶活性的變化曲線較平緩，保存至40 d時(shí)超氧化物歧化酶活性仍為原來(lái)的72.7%。

2.3 花粉萌發(fā)率與過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的關(guān)系

紫玉蘭花粉萌發(fā)率與花粉的過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性之間均呈正相關(guān)關(guān)系，且萌發(fā)率與過(guò)氧化物酶活性的正相關(guān)顯著(P＜0.05)，與超氧化物歧化酶活性的正相關(guān)極顯著(P＜0.01)，說(shuō)明在紫玉蘭花粉的貯藏過(guò)程中，過(guò)氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性對(duì)花粉萌發(fā)率起著主導(dǎo)作用，即超氧化物歧化酶活性對(duì)花粉萌發(fā)率的影響作用大于過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性的，過(guò)氧化物酶活性的作用大于過(guò)氧化氫酶活性的。

3 結(jié)論與討論

紫玉蘭花粉貯藏對(duì)實(shí)現(xiàn)與廣玉蘭的雜交育種具有重要意義。貯藏后的花粉保持較高的萌發(fā)率和較強(qiáng)的生活力是評(píng)價(jià)花粉貯藏成敗的兩個(gè)指標(biāo)[4，8]。在本試驗(yàn)條件下，紫玉蘭花粉的最佳貯藏溫度是－20和－70℃，且貯藏40 d時(shí)紫玉蘭花粉萌發(fā)率仍有19%和38%，此時(shí)正值廣玉蘭的盛花期，為雜交育種的較佳時(shí)期。利用－20和－70℃條件下貯藏的紫玉蘭花粉與廣玉蘭雜交，成功率還是較高的。

自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，而一旦平衡被打破，就會(huì)出現(xiàn)逆境脅迫[5，9]。貯藏花粉，首先要進(jìn)行花粉貯藏前的預(yù)處理，即將花粉的含水率降至10%左右，形成水分脅迫。在這種條件下，花粉動(dòng)員其體內(nèi)的過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等保護(hù)酶系統(tǒng)清除由水分脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定，保護(hù)細(xì)胞免遭膜脂氧化的傷害，這是細(xì)胞對(duì)脅迫產(chǎn)生的自我保護(hù)機(jī)制，是一種保護(hù)性適應(yīng)[4];隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉細(xì)胞不斷失水，水分脅迫加重，同時(shí)活性氧代謝失調(diào)不斷累積，花粉細(xì)胞不斷衰老，出現(xiàn)氧化脅迫，在水分、低溫和氧化三重脅迫下，紫玉蘭花粉的過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶酶活性不足以補(bǔ)償因脅迫而造成的傷害，致使細(xì)胞逐漸失活、死亡。本試驗(yàn)表明，在紫玉蘭花粉的貯藏過(guò)程中，室溫條件下花粉的過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性均呈下降趨勢(shì)，且花粉萌發(fā)率也是急劇下降，貯藏至30～40 d時(shí)，萌發(fā)率接近零，這可能是室溫條件對(duì)花粉的脅迫過(guò)于嚴(yán)重，花粉自身的保護(hù)酶系統(tǒng)來(lái)不及啟動(dòng)，花粉細(xì)胞就死亡了，因此說(shuō)要中長(zhǎng)期貯藏花粉，室溫條件是不可行的;4℃條件下花粉的過(guò)氧化物酶首先啟動(dòng)，即在花粉貯藏至10 d時(shí)就有升高的趨勢(shì)，單一的過(guò)氧化物酶酶的抗氧化能力有限，隨著脅迫的加劇，過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶酶也先后啟動(dòng)，分別在20和30 d時(shí)達(dá)到高峰，此時(shí)也是花粉萌發(fā)率快速下降的時(shí)期，之后3種酶活性又下降，4℃條件適合10～20 d的短期花粉貯藏;－20和－70℃條件下的花粉過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶酶變化趨勢(shì)較一致，只是－70℃條件下的花粉酶活性變化幅度較小、高峰值出現(xiàn)的較晚，且其花粉萌發(fā)率也較高，40 d時(shí)還有38%的花粉具有生活力，－70℃更適合進(jìn)行長(zhǎng)期的花粉保存，具體到何時(shí)花粉失活，有待進(jìn)一步研究。

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