李少一 王志超 高 蕓 李曉東 張明杰 馬維寧 劉云會

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110041)

1996年，F(xiàn)AT10在人類的Ⅰ類主要組織相容性復合體(MHCⅠ類)區(qū)域被發(fā)現(xiàn)〔1〕，此后FAT10被報道與肝癌的發(fā)生密切相關，在90%以上的肝癌過表達，而在毗鄰的非肝癌組織中FAT10在轉錄水平和蛋白水平均檢測不到〔2〕。近期的研究顯示，F(xiàn)AT10在膠質(zhì)瘤中也存在過表達現(xiàn)象〔3〕，并與膠質(zhì)瘤的進展與預后不良密切相關，在老年人群中尤為明顯。FAT10，又稱雙泛素，由165個氨基酸殘基組成，分子量18 kD，屬于泛素蛋白家族中的泛素樣修飾蛋白(UBLs)，由兩個泛素樣部分前后融合而成〔4，5〕。FAT10的功能涉及很多方面，包括信號轉導、蛋白移位和細胞周期調(diào)節(jié)等。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、OPTI培養(yǎng)基、胎牛血清，購自Invitrogen公司，RIPA細胞裂解液購自北京百泰克生物科技公司，F(xiàn)AT10、Stat1單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗鼠IgG抗體購自Pierce公司，Stat1 siRNA購自Sigma公司。人膠質(zhì)瘤細胞株U251購自ATCC公司。

1.2 序列分析 FAT10轉錄起始點上游的啟動子及其上游調(diào)控區(qū)的2 500bp序列從ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/)下載，采用 TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(Version 8.3)在線預測FAT10基因上游調(diào)控序列的(http://alggen.lsi.upc.es/)轉錄因子結合位點。

1.3 電穿孔轉染 離心收集細胞，重懸細胞于OPTI培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度至1×107細胞/ml，加入1 μg的Stat1 siRNA混勻后移入2 mm電轉杯，電擊條件為120 V，20 ms，將細胞分3份轉入6孔培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞TNF-α處理 Stat1干擾組及陰性對照組電穿孔轉染24 h后，給予50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后收集細胞用于Western印跡檢測。而核型分析實驗中，經(jīng)電穿孔轉染24 h和50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后，更換為普通培養(yǎng)液，2 d后重復進行電穿孔和TNF-α刺激，重復5次后收集細胞進行核型分析。

1.5 Western印跡檢測 用RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，變性處理后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入單抗4℃過夜后，再加1∶1 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育30 min，經(jīng)PBST清洗3次，ECL發(fā)光顯影。

1.6 核型分析 收集各組細胞，經(jīng)0.075 mol/L的KCl室溫下低滲30 min處理后，用新配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)于-20℃固定2 h，采用冷片法滴片，空氣干燥過夜。干燥后的染色體玻片用Giemsa染液染色10 min，選取50個染色體中期分裂相進行染色體計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 FAT10基因啟動子區(qū)的炎性轉錄因子結合位點的預測采用生物學軟件預測了FAT10基因-2 500～+250區(qū)段，核因子(NF)-κB、Stat1、Stat3炎性轉錄因子的結合位點。結果見圖1，其中NF-κB結合位點7個，Stat1結合位點7個，Stat3結合位點3個。

圖3 核型分析

圖1 FAT10上游－2 500～+250區(qū)段假定炎性因子結合位點

2.2 Stat1小干擾RNA沉默效率及FAT10蛋白水平檢測Western印跡結果顯示，經(jīng)TNF-α刺激后FAT10蛋白表達量升高明顯。與陰性對照組(si Ctr)和空白對照組比較，Stat1干擾組(si Stat1)Stat1的蛋白表達水平下降，說明進行siRNA干擾后，有效抑制了U251細胞中Stat1的表達。而TNF-α誘導的FAT10高表達，在Stat1干擾組也明顯降低，表明通過抑制Stat1可以有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達。見圖2。

2.3 核型分析 對各組處理細胞的中期分裂相染色體的觀察表明:對照組U251細胞(Ctr)正常二倍體染色體數(shù)目為60～69，占計數(shù)細胞總數(shù)的85%;而經(jīng)過TNF-α處理后的U251細胞(TNF-α/si Ctr)的正常二倍體染色體比例下降到37.5%(與對照組比較有顯著差異，P＜0.01);而Stat siRNA干擾組U251細胞(TNF-α/si Stat1)正常二倍體染色體比例接近對照組，為80%(與TNF-α處理組比較有顯著差異，P＜0.01)。見圖3。結果提示，TNF-α可以誘導非整倍體的出現(xiàn)，而采用si Stat1沉默Stat1后，可以通過有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達而阻斷TNF-α誘導的U251細胞的核型異常。

3 討論

現(xiàn)代細胞遺傳學和分子生物學研究證明，大多數(shù)腫瘤細胞特別是實體瘤細胞核體外轉化細胞，常表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定(CIN)，非整倍體是主要表現(xiàn)形式之一，即整條染色體的獲得或者缺失。Duesberg研究發(fā)現(xiàn)，非整倍體的出現(xiàn)，可以通過破壞細胞周期檢測點和平衡機制，導致細胞癌變〔6，7〕。

FAT10作為類泛素家族成員，被發(fā)現(xiàn)在肝癌、膠質(zhì)瘤、大腸癌等惡性腫瘤中表達增高〔2，3，8〕，但在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但具體作用機制還不很清楚。FAT10作為重要炎性因子TNF-α下游因子，有報道顯示，F(xiàn)AT10通過與MAD2(mitotic arrest deficient 2)非共價結合〔2，4〕，導致染色體不穩(wěn)定。MAD2是保證染色體向兩極移動的重要的物質(zhì)基礎，其在著絲粒上的缺乏，可能導致部分染色體分離異?！?〕。在細胞有絲分裂的前、中期，高表達的FAT10可以降低定位在著絲粒上的MAD2，導致染色體不分離和染色體不穩(wěn)定，出現(xiàn)非整倍體細胞。本研究結果顯示，siRNA干擾有效抑制U251細胞中Stat1的表達后，可以通過抑制Stat1有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達，進而通過有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達而阻斷TNF-α誘導的非整倍體現(xiàn)象。FAT10作為重要炎性因子TNF-α下游因子，具有參與慢性炎癥相關性腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛能，解析TNF-α/NF-κB/FAT10路徑調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展進程的分子機制，有助于進一步尋找有效的膠質(zhì)瘤治療靶標。

圖2 Stat1和FAT10的蛋白表達結果

1 Fan W，Cai W，Parimoo S，et al.Identification of seven new human MHC class I region genes around the HLA-F locus〔J〕.Immunogenetics，1996;44(2):97-103.

2 Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al.Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gastrointestinal and gynecological cancers〔J〕.Oncogene，2003;22(17):2592-603.

3 Yuan J，Tu Y，Mao X，et al.Increased expression of FAT10 is correlated with progression and prognosis of human glioma〔J〕.Pathol Oncol Res，2012;18(4):833-9.

4 Ren J，Kan A，Leong SH，et al.FA10 plays a role in the regulation of chromosomal stability〔J〕.J Biol Chem，2006;281(16):11413-21.

5 Pierron R.Magnetic resonance imaging in the evaluation of knee injuries〔J〕.South Med J，1992;85(7):783.

6 Sch?fer M，Werner S.Cancer as an overhealing wound:an old hypothesis revisited〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2008;9(8):628-38.

7 Li R，Sonik A，Stindl R，et al.Aneuploidy vs.gene mutation hypothesis of cancer:recent study claims mutation but is found to support aneuploidy〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(7):3236-41.

8 Lukasiak S，Schiller C，Oehlschlaeger P，et al.Proinflammatory cytokines cause FAT10 upregulation in cancers of liver and colon〔J〕.Oncogene，2008;27(46):6068-74.

9 Wang X，Jin DY，Wong YC，et al.Correlation of defective mitotic checkpoint with aberrantly reduced expression of MAD2 protein in nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Carcinogenesis，2000;21(12):2293-7.