吳憲，張國財，張杰＊，王連寬，趙博，王婷玉，林連男，張卓然

（1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040；3.大楊樹林業(yè)局）

蛹蟲草〔Cordyceps militaris（vuill.）Fr.〕又稱北冬蟲夏草、北蟲草，屬子囊菌類麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬［1］。其藥用價值與臨床功效與天然冬蟲夏草極為相似。天然冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc〕是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有抗衰老、抗病原微生物、抗腫瘤等多種功效［2］。但至今未能實現(xiàn)有效的子實體人工培養(yǎng)及規(guī)?；a(chǎn)，無法滿足市場的大量需求。而人工栽培的北蟲草作為野生蟲草的替代品，市場空間大，效益高。因此，本文對6個蛹蟲草菌株進行菌落培養(yǎng)、人工栽培，并對子實體生物轉化率與主要活性物質(zhì)含量進行分析比較，篩選出優(yōu)良菌株，為規(guī)?；a(chǎn)提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

1號菌株來自沈陽棋盤山；2號菌株來自沈陽于洪區(qū)；3號菌株來自遼寧錦州；4號菌株來自于東北林業(yè)大學生命科學學院；5、6號菌株均來自綏化市望奎縣。以上蛹蟲草菌株均保存于東北林業(yè)大學林學院森林保護學科實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨5g／L，瓊脂20g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB150mg／L。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨7g／L，KH2PO42g／L，MgSO4g／L，VB150mg／L。營養(yǎng)液：馬鈴薯200g／L（煮汁），KH2PO42g／L，MgSO41g／L，蛋白胨5g／L，取500mL培養(yǎng)瓶，每瓶加入小麥30g，培養(yǎng)液50mL，121℃滅菌40min，冷卻過夜。

1.2 方法

1.2.1 菌落培養(yǎng)方法

用經(jīng)滅菌直徑為5mm打孔器取活化的蛹蟲草菌片接種于PDA平板正中央，封口于22℃自然光下連續(xù)培養(yǎng)19d，每隔2d測定菌落直徑，觀察顏色變化，測定生長速率。

1.2.2 人工栽培方法

將活化后的蛹蟲草菌餅接入裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，22℃往復震蕩培養(yǎng)7d，靜置1d確保無雜菌后，用無菌水稀釋5倍即為栽培用液體菌種。無菌操作接液體菌種5mL于培養(yǎng)瓶中，置于發(fā)菌室中于18℃，濕度為60%條件下，避光培養(yǎng)7d，待菌絲長滿后在聚丙烯膜上扎眼，在22℃，環(huán)境濕度為80%～90%條件下培養(yǎng)45d，每日散射光照12h，記錄形態(tài)，采收，60℃恒溫烘干至恒重保存。

1.2.3 子實體營養(yǎng)成分測定

蟲草酸含量測定［3］（甘露醇）：將干燥的子實體放入電動粉碎機中粉碎，取粉末2.5g于100mL燒瓶中，60mL 50%乙醇溶液，沸水浴進行3h回流，真空抽濾，收集濾液稀釋2000倍后，取1mL于試管中依次加入1mL高碘酸鉀稀鹽酸溶液（15mmol／L），2mL鼠李糖溶液（1mg／mL），4mL新鮮Nash試劑，53℃水浴恒溫15min，快速冷卻后用紫外分光光度計測定其在412nm波長下吸光度。

粗多糖含量測定：取1g研磨好的子實體粉末加入5mL蒸餾水，20mL無水乙醇，渦旋震蕩，超聲30min，4000r／min離心10min，棄上清，沉淀用80%乙醇溶液清洗2次，加入蒸餾水50mL，沸水浴回流3h，過濾收集取上清液，稀釋1000倍后備用，采用硫酸苯酚法測定［4］，紫外分光光度計測得490nm吸光度。

蟲草素及腺苷含量測定［5］：取蛹蟲草粉末1g加入6mL乙醚超聲3次，3000r／min離心10min，棄上清，揮發(fā)盡乙醚，加入蒸餾水8mL，超聲3次，過濾，合并濾液，60℃旋轉蒸發(fā)儀蒸干，用6%乙腈溶液溶解，0.22μm濾膜過濾后備用。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蟲草素、腺苷含量：流動相：6%乙腈溶液；流速：0.6mL／min；檢測波長：260nm；保留時間：15min。蟲草素標準曲線方程：y＝2E－08 x＋4E－05，r＝0.9998；腺苷標準曲線方程：y＝2E－08 x－0.0003，r＝0.998。

2 結果分析

2.1 菌落培養(yǎng)實驗結果

表1 不同菌株菌絲生長試驗結果

由表1可知，2號菌株生長最快，菌落整齊，轉色較好，3號菌株萌發(fā)遲緩、長勢差、轉色慢。

2.2 人工栽培試驗結果

2.2.1 人工栽培子實體描述

2號與5號菌株子實體橙黃色，柄粗，頭部膨大呈球形，部分頭部發(fā)白，出草整齊均勻，長勢密集；1號菌株橙黃色，柄細，子實體矮小，長勢稀疏；4號子實體橙黃色，柄粗，子實體矮小，長勢稀疏；3，6號菌株子實體橙黃色，柄粗細適中，長勢疏密適中，子實體長度適中。

圖1 不同菌株人工栽培子實體形態(tài)

2.2.2 人工栽培實驗結果

每種菌株隨機抽取30瓶蛹蟲草進行樣品處理，稱得其鮮草重量、干草重量，計算出平均鮮重、干重以及鮮干比與生物轉化率。由表2可知，2號菌株的平均干重和鮮重等均高于其它菌株。說明2號的產(chǎn)量最高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 不同菌株人工栽培試驗結果

2.3 子實體活性成分分析

提取并測定不同菌株中所含的活性物質(zhì)：蟲草酸、粗多糖、蟲草素、腺苷的含量作為篩選優(yōu)良菌株的重要指標。高效液相色譜法測定蟲草酸、腺苷含量。由表3可知，2號菌株和5號菌株所含活性成分含量均高于其它菌株。

圖2 高效液相色譜圖

表3 不同菌株子實體活性成分分析試驗結果 mg·g－1

3 結論

通過對不同蛹蟲草菌株的菌絲生長狀態(tài)的觀察與生長速率的測定，人工栽培子實體形態(tài)的觀察及生物轉化率的測定以及對不同菌株子實體中活性成分的測定與分析，得出以下結論：6種蛹蟲草菌株中的2號菌株菌絲萌發(fā)快、長勢好，子實體形態(tài)優(yōu)良、產(chǎn)量高，子實體中所含活性成分較高。適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，是值得推廣的優(yōu)良菌種。

［1］ 吳畏，高新華，崔星明，等.北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）的研究應用概況（綜述）［J］.上海農(nóng)業(yè)學報，2000，16（增刊）：99－104.

［2］ Zhu J.S，Halpern G.M，Jones K，The scientific rediscovery of an ancient Chinese medicine herbal：Cordyceps sinensis［J］.Journal of Alternative and Complementary Medicine，1988，4（3）：289－303（I）；4（4）：429－457.

［3］ 葛新，白小蘭，李云蘭，等.分光光度法測定蛹蟲草D－蟲草酸的含量［J］.山西醫(yī)科大學學報，2001，32（4）：317－318.

［4］ 白云娥，王毅，劉許媛，等.冬蟲夏草、亞香棒蟲草中多糖的含量測定［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2001，21（1）：19－20.

［5］ 潘錫強，張詩鳴，陳曉鴻.用HPLC法測定東方神草沖劑中腺苷的含量［J］.中成藥，1994；16（10）：12－14.