馮雪，張曜武，曹炳星，王薇薇

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042）

紅松（PinuskoraiensisSieb.et Zucc）又名果松，屬于松科植物，主要分布在我國(guó)東北長(zhǎng)白山到小興安嶺一帶。很早之前日本民間就流傳用松塔煮水治療胃癌的偏方［1］。化學(xué)成分研究表明，紅松松塔中含有萜類、木質(zhì)素、黃酮、揮發(fā)油、維生素類、棕櫚堿、礦物質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)，以及脂肪等多種成分［2］。藥理研究證實(shí)松塔多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒等功效，其中調(diào)節(jié)免疫機(jī)能及抑制腫瘤等功效尤為突出。在日本已將松塔多糖作為健康食品和醫(yī)藥品的原料，并已申請(qǐng)了專利［3］。

目前，植物多糖含量測(cè)定的常用方法有苯酚-硫酸法和DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）等方法，其中DNS法過程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，且測(cè)定結(jié)果少受雜質(zhì)干擾［4］，尤其適用于含有雜質(zhì)組分的多糖樣品；此外，不使用具有腐蝕作用的濃硫酸，亦為本法之突出優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中嘗試將DNS法用于紅松松塔多糖成分的含量測(cè)定，進(jìn)行了以下系列研究，該工作尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料

1.1 材料

紅松松塔多糖提取物（本實(shí)驗(yàn)室制備）；葡萄糖；苯酚；NaOH；Na2SO3；酒石酸鉀鈉；3，5-二硝基水楊酸；鹽酸（以上試劑均為分析純）。

1.2 儀器

FA1004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SHZ-III式循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 相關(guān)溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取105℃恒重的葡萄糖對(duì)照品50mg，精密稱定，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，稀釋、定容，即得葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備

取紅松松塔多糖提取物樣品400mg，精密稱定，加適量純水，沸水浴中加熱振搖使溶解，趁熱過濾，熱水沖洗濾渣，將洗液、濾液混合，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，稀釋、定容即得樣品溶液。

2.1.3 總糖溶液的制備

精密量取樣品溶液2.5mL，加水2.5mL，加6mol／L鹽酸溶液15mL，在沸水浴中加熱40min，流水冷卻至室溫，加酚酞指示液1滴，搖勻，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，轉(zhuǎn)移至25mL容量中，稀釋、定容即得。

2.1.4 單糖溶液的制備

精密量取樣品溶液5mL，置于10mL容量瓶中，加酚酞指示液1滴，搖勻，用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，稀釋、定容即得。

2.1.5 DNS顯色液的制備

甲液：溶解2.3g苯酚于5mL 10%NaOH中并稀釋到23mL，在此溶液中加入2.3g Na2SO3，溶解混勻即得；

乙液：稱取85g酒石酸鉀鈉，將其加入100mL 10%的NaOH中，再加入293mL 1%的3，5-二硝基水楊酸溶液，混勻即得；

將甲、乙溶液相混合，即得黃色溶液，貯存于棕色試劑瓶，室溫下陰暗處放置7～10天后使用。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的考察

2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密量取對(duì)照品溶液0.8mL、總糖溶液和單糖溶液各1mL，加水使成2mL，分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻，在沸水浴中加熱7min后，立即用流水冷卻至室溫，加水3mL搖勻，用相應(yīng)的試劑做空白，照分光光度法在400～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，吸光度變化曲線如圖1。

圖1 400～600nm范圍內(nèi)各溶液吸收曲線圖

由圖1可知，對(duì)照品溶液、總糖溶液和單糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）均為490mn，所以選擇490nm作為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.2 水解條件的考察

（1）酸用量的確定。精密量取樣品溶液4份，每份2.5mL，各加水2.5mL，分別加6mol／L鹽酸溶液5、10、15、20mL，在沸水浴中加熱30min，用流水冷卻后加酚酞指示液1滴，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，分別轉(zhuǎn)移至25mL容量中，定容。每份取2mL，分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻，在沸水浴中加熱7min后，立即用流水冷卻至室溫，加水3mL搖勻，用相應(yīng)的試劑做空白，在490nm測(cè)吸收度A。酸用量對(duì)吸光度的影響如圖2。

圖2 酸用量對(duì)吸光度的影響

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)中，酸用量為15mL時(shí)，吸光度為最大值，即使酸用量再增大，吸光度也不再增加。因此選擇15mL為適宜酸用量。

（2）水解時(shí)間的確定。精密量取樣品溶液5份，每份 2.5mL，各加水 2.5mL、6mol／L 鹽酸溶液15mL，分別在沸水浴中加熱10、20、30、40、50min后，流水冷卻至室溫，加酚酞指示液1滴，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，轉(zhuǎn)移至25mL容量中，定容。依照（1）酸用量測(cè)定中的相同方法，自“每份取2mL”起，依法測(cè)定。水解時(shí)間對(duì)吸光度的影響如圖3。

圖3 水解時(shí)間對(duì)吸光度的影響

由圖3可知，40min時(shí)吸光度為最大值，即水解時(shí)間為40min時(shí)，多糖水解完全。所以選擇40min為適宜水解時(shí)間。

2.2.3 顯色條件的考察

（1）DNS顯色液用量的確定。精密量取0.8mL葡萄糖對(duì)照溶液，平行6份，加水使成2mL，分別精密加入 DNS顯色液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，混勻，依法測(cè)定。DNS顯色液用量對(duì)吸光度的影響如圖4。

圖4 DNS顯色液用量對(duì)吸光度的影響

由圖4可知，DNS顯色液用量為2.5mL時(shí)吸光度最大，說明DNS顯色液用量為2.5mL時(shí)反應(yīng)完全，故DNS顯色液最佳用量為2.5mL。

（2）顯色時(shí)間的確定。精密量取0.8mL葡萄糖對(duì)照溶液，平行4份，加水使成2mL，分別精密加入DNS顯色液2.5mL，混勻，分別沸水浴3、5、7、10min，取出，依法測(cè)定。顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響見圖5。

圖5 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

由圖5可知顯色時(shí)間7min時(shí)吸光度最大，所以選擇最佳顯色時(shí)間為7min。

2.3 DNS法方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察

精密量取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，加水使成2mL，依法測(cè)定。以葡萄糖濃度（mg／mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制490nm標(biāo)準(zhǔn)曲線、得出回歸方程，見圖6。

圖6 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6可知標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝18.7x-0.2232（R2＝0.9993），在20～67mg／L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取總糖樣品溶液、單糖樣品溶液各6份，每份2mL，依法測(cè)定，相關(guān)數(shù)據(jù)記錄見表1。結(jié)果表明該法精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品5份，依法制備、測(cè)定，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。由表可知該方法重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取水、單糖溶液、總糖溶液各2mL，依法測(cè)定。每隔30min測(cè)定1次，共測(cè)2h，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明該方法2h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取多糖粗品5份，每份約20mg，精密稱定，精密加入葡萄糖對(duì)照品5mg，依法制備、測(cè)定。結(jié)果如表4所示，表明樣品回收率理想，此方法可行。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品多糖含量測(cè)定

依法對(duì)三批樣品進(jìn)行制備、測(cè)定，結(jié)果如表5。

表5 樣品含量測(cè)定

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響頗為明顯，經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察后選擇490nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，最佳水解條件為酸用量15mL、水解時(shí)間40min，最佳顯色條件為顯色劑用量2.5mL、顯色時(shí)間7min。方法學(xué)考察結(jié)果顯示：穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度等均在規(guī)定范圍內(nèi)，平均加樣回收率99.47%，RSD＝1.68%。該方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于紅松松塔多糖含量測(cè)定。

［1］ Sakagami H，Takeda K，MakinoY，et al.Partial purification of novel differentiation-inducing substances（s）from hot water extract of Japanese pine cone［J］.Jep.J.Cancer Res，1986，77（1）：59-61.

［2］ 王智航，張永紅，于婉婷，等.紅松松塔、松子殼研究進(jìn)展及在畜牧業(yè)中應(yīng)用可行性分析［J］.國(guó)外畜牧學(xué)——豬與禽，2009，29（4）：88-89.

［3］ 劉光明，呂永俊，周萍，等.松屬植物的松塔、松子殼藥用開發(fā)［J］.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，6（12）：78-80.

［4］ 李衛(wèi)彬，陽(yáng)文輝，黃鎖義，等.當(dāng)歸總糖還原糖和多糖的含量測(cè)定方法探討［J］.微量元素與健康研究，2008，25（3）：46-47.