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        DNS法測(cè)定紅松松塔多糖含量的研究

        2013-12-28 07:54:06馮雪張曜武曹炳星王薇薇
        中國(guó)林副特產(chǎn) 2013年3期
        關(guān)鍵詞:總糖定容光度

        馮雪,張曜武,曹炳星,王薇薇

        (青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266042)

        紅松(PinuskoraiensisSieb.et Zucc)又名果松,屬于松科植物,主要分布在我國(guó)東北長(zhǎng)白山到小興安嶺一帶。很早之前日本民間就流傳用松塔煮水治療胃癌的偏方[1]。化學(xué)成分研究表明,紅松松塔中含有萜類(lèi)、木質(zhì)素、黃酮、揮發(fā)油、維生素類(lèi)、棕櫚堿、礦物質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì),以及脂肪等多種成分[2]。藥理研究證實(shí)松塔多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒等功效,其中調(diào)節(jié)免疫機(jī)能及抑制腫瘤等功效尤為突出。在日本已將松塔多糖作為健康食品和醫(yī)藥品的原料,并已申請(qǐng)了專(zhuān)利[3]。

        目前,植物多糖含量測(cè)定的常用方法有苯酚-硫酸法和DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)等方法,其中DNS法過(guò)程簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,且測(cè)定結(jié)果少受雜質(zhì)干擾[4],尤其適用于含有雜質(zhì)組分的多糖樣品;此外,不使用具有腐蝕作用的濃硫酸,亦為本法之突出優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中嘗試將DNS法用于紅松松塔多糖成分的含量測(cè)定,進(jìn)行了以下系列研究,該工作尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。

        1 材料

        1.1 材料

        紅松松塔多糖提取物(本實(shí)驗(yàn)室制備);葡萄糖;苯酚;NaOH;Na2SO3;酒石酸鉀鈉;3,5-二硝基水楊酸;鹽酸(以上試劑均為分析純)。

        1.2 儀器

        FA1004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、SHZ-III式循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))、T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 相關(guān)溶液的制備

        2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

        取105℃恒重的葡萄糖對(duì)照品50mg,精密稱(chēng)定,加適量水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,稀釋、定容,即得葡萄糖對(duì)照品溶液。

        2.1.2 樣品溶液的制備

        取紅松松塔多糖提取物樣品400mg,精密稱(chēng)定,加適量純水,沸水浴中加熱振搖使溶解,趁熱過(guò)濾,熱水沖洗濾渣,將洗液、濾液混合,轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中,稀釋、定容即得樣品溶液。

        2.1.3 總糖溶液的制備

        精密量取樣品溶液2.5mL,加水2.5mL,加6mol/L鹽酸溶液15mL,在沸水浴中加熱40min,流水冷卻至室溫,加酚酞指示液1滴,搖勻,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色,轉(zhuǎn)移至25mL容量中,稀釋、定容即得。

        2.1.4 單糖溶液的制備

        精密量取樣品溶液5mL,置于10mL容量瓶中,加酚酞指示液1滴,搖勻,用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色,稀釋、定容即得。

        2.1.5 DNS顯色液的制備

        甲液:溶解2.3g苯酚于5mL 10%NaOH中并稀釋到23mL,在此溶液中加入2.3g Na2SO3,溶解混勻即得;

        乙液:稱(chēng)取85g酒石酸鉀鈉,將其加入100mL 10%的NaOH中,再加入293mL 1%的3,5-二硝基水楊酸溶液,混勻即得;

        將甲、乙溶液相混合,即得黃色溶液,貯存于棕色試劑瓶,室溫下陰暗處放置7~10天后使用。

        2.2 實(shí)驗(yàn)條件的考察

        2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

        精密量取對(duì)照品溶液0.8mL、總糖溶液和單糖溶液各1mL,加水使成2mL,分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻,在沸水浴中加熱7min后,立即用流水冷卻至室溫,加水3mL搖勻,用相應(yīng)的試劑做空白,照分光光度法在400~600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,吸光度變化曲線(xiàn)如圖1。

        圖1 400~600nm范圍內(nèi)各溶液吸收曲線(xiàn)圖

        由圖1可知,對(duì)照品溶液、總糖溶液和單糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)均為490mn,所以選擇490nm作為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

        2.2.2 水解條件的考察

        (1)酸用量的確定。精密量取樣品溶液4份,每份2.5mL,各加水2.5mL,分別加6mol/L鹽酸溶液5、10、15、20mL,在沸水浴中加熱30min,用流水冷卻后加酚酞指示液1滴,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色,分別轉(zhuǎn)移至25mL容量中,定容。每份取2mL,分別精密加入DNS顯色液2.5mL混勻,在沸水浴中加熱7min后,立即用流水冷卻至室溫,加水3mL搖勻,用相應(yīng)的試劑做空白,在490nm測(cè)吸收度A。酸用量對(duì)吸光度的影響如圖2。

        圖2 酸用量對(duì)吸光度的影響

        由圖2可知,本實(shí)驗(yàn)中,酸用量為15mL時(shí),吸光度為最大值,即使酸用量再增大,吸光度也不再增加。因此選擇15mL為適宜酸用量。

        (2)水解時(shí)間的確定。精密量取樣品溶液5份,每份 2.5mL,各加水 2.5mL、6mol/L 鹽酸溶液15mL,分別在沸水浴中加熱10、20、30、40、50min后,流水冷卻至室溫,加酚酞指示液1滴,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色,轉(zhuǎn)移至25mL容量中,定容。依照(1)酸用量測(cè)定中的相同方法,自“每份取2mL”起,依法測(cè)定。水解時(shí)間對(duì)吸光度的影響如圖3。

        圖3 水解時(shí)間對(duì)吸光度的影響

        由圖3可知,40min時(shí)吸光度為最大值,即水解時(shí)間為40min時(shí),多糖水解完全。所以選擇40min為適宜水解時(shí)間。

        2.2.3 顯色條件的考察

        (1)DNS顯色液用量的確定。精密量取0.8mL葡萄糖對(duì)照溶液,平行6份,加水使成2mL,分別精密加入 DNS顯色液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,混勻,依法測(cè)定。DNS顯色液用量對(duì)吸光度的影響如圖4。

        圖4 DNS顯色液用量對(duì)吸光度的影響

        由圖4可知,DNS顯色液用量為2.5mL時(shí)吸光度最大,說(shuō)明DNS顯色液用量為2.5mL時(shí)反應(yīng)完全,故DNS顯色液最佳用量為2.5mL。

        (2)顯色時(shí)間的確定。精密量取0.8mL葡萄糖對(duì)照溶液,平行4份,加水使成2mL,分別精密加入DNS顯色液2.5mL,混勻,分別沸水浴3、5、7、10min,取出,依法測(cè)定。顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖5。

        圖5 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

        由圖5可知顯色時(shí)間7min時(shí)吸光度最大,所以選擇最佳顯色時(shí)間為7min。

        2.3 DNS法方法學(xué)考察

        2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系的考察

        精密量取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mL的葡萄糖對(duì)照品溶液,加水使成2mL,依法測(cè)定。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)繪制490nm標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、得出回歸方程,見(jiàn)圖6。

        圖6 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        由圖6可知標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=18.7x-0.2232(R2=0.9993),在20~67mg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

        2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

        精密量取總糖樣品溶液、單糖樣品溶液各6份,每份2mL,依法測(cè)定,相關(guān)數(shù)據(jù)記錄見(jiàn)表1。結(jié)果表明該法精密度良好。

        表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

        取同一批號(hào)樣品5份,依法制備、測(cè)定,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。由表可知該方法重現(xiàn)性良好。

        表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        精密量取水、單糖溶液、總糖溶液各2mL,依法測(cè)定。每隔30min測(cè)定1次,共測(cè)2h,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明該方法2h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

        取多糖粗品5份,每份約20mg,精密稱(chēng)定,精密加入葡萄糖對(duì)照品5mg,依法制備、測(cè)定。結(jié)果如表4所示,表明樣品回收率理想,此方法可行。

        表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.4 樣品多糖含量測(cè)定

        依法對(duì)三批樣品進(jìn)行制備、測(cè)定,結(jié)果如表5。

        表5 樣品含量測(cè)定

        3 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響頗為明顯,經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察后選擇490nm作為測(cè)定波長(zhǎng),最佳水解條件為酸用量15mL、水解時(shí)間40min,最佳顯色條件為顯色劑用量2.5mL、顯色時(shí)間7min。方法學(xué)考察結(jié)果顯示:穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度等均在規(guī)定范圍內(nèi),平均加樣回收率99.47%,RSD=1.68%。該方法操作簡(jiǎn)便,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于紅松松塔多糖含量測(cè)定。

        [1] Sakagami H,Takeda K,MakinoY,et al.Partial purification of novel differentiation-inducing substances(s)from hot water extract of Japanese pine cone[J].Jep.J.Cancer Res,1986,77(1):59-61.

        [2] 王智航,張永紅,于婉婷,等.紅松松塔、松子殼研究進(jìn)展及在畜牧業(yè)中應(yīng)用可行性分析[J].國(guó)外畜牧學(xué)——豬與禽,2009,29(4):88-89.

        [3] 劉光明,呂永俊,周萍,等.松屬植物的松塔、松子殼藥用開(kāi)發(fā)[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào),2007,6(12):78-80.

        [4] 李衛(wèi)彬,陽(yáng)文輝,黃鎖義,等.當(dāng)歸總糖還原糖和多糖的含量測(cè)定方法探討[J].微量元素與健康研究,2008,25(3):46-47.

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