樓旭丹 汪海東 陳 芳 夏世金 孫 皎 (復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200040)

白細(xì)胞介素-17(IL-17)是新發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子，由初始CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化的新型效應(yīng)性輔助性T細(xì)胞(Th17)產(chǎn)生〔1〕。早期基于小鼠的研究指出Th17細(xì)胞是自身免疫性疾病發(fā)生時(shí)的一種病理性細(xì)胞，可伴隨IL-17在血清及局部組織中的表達(dá)增加。IL-17與特異性受體(IL-17R)結(jié)合后通過磷酸肌醇3肌酶/蛋白激酶B/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(PI3K-Akt-ERK)依賴途徑、絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑等炎癥信號傳導(dǎo)通路活化多種細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)〔2〕，因此被認(rèn)為與組織炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病密切相關(guān)。本文前期工作證實(shí)在自身免疫性糖尿病小鼠發(fā)病初期，IL-17蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，而且IL-17可加速自身免疫性非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰島炎和糖尿病的發(fā)生〔3〕，但I(xiàn)L-17在糖尿病大血管病變患者血清中的表達(dá)變化尚未可知。本研究旨在探討IL-17與T2DM大血管病變之間的相關(guān)性，為臨床診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 T2DM組162例(男75例，女87例)，均為我院2011～2012年住院及門診患者，符合1999年世界衛(wèi)生組織WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡38～67〔平均(58.84±10.51)〕歲，根據(jù)是否合并糖尿病血管病變，分為大血管病變組90例和無血管病變組72例。大血管病變診斷至少應(yīng)符合以下任1條標(biāo)準(zhǔn):有心絞痛或心肌梗死病史，經(jīng)動態(tài)心電圖和超聲心動圖或經(jīng)冠狀動脈造影確診的臨床冠心病;有腦血管意外病史，頭顱CT或MRI掃描明確有缺血病灶;多普勒超聲檢查可見頸或雙下肢動脈血管壁硬化斑塊或血栓形成或動脈廣泛不規(guī)則狹窄;下肢缺血性臨床表現(xiàn)(間歇性跛行、缺血性疼痛、壞疽等)。正常對照組68例(男31例，女37例)，為同期查體健康者，年齡41～65〔平均(56.19±9.06)〕歲，空腹及餐后2 h血糖均正常。組間年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。排除糖尿病急性并發(fā)癥及其他可導(dǎo)致糖代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病;嚴(yán)重心、腦、血管并發(fā)癥，包括6個(gè)月內(nèi)有急性心肌梗死、血管成形術(shù)及有應(yīng)激史(外傷、手術(shù)、精神刺激等);肝、腎功能不全或合并急、慢性感染者;嚴(yán)重原發(fā)性疾病，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病;近期使用羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑、降糖藥物或胰島素治療者。

1.2 臨床資料 對研究對象測量身高、體重，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)〔BMI=體重(kg)/身高(m)2〕，測量坐位，收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)，2次取平均值。所有受試者均在基礎(chǔ)狀態(tài)下普通飲食，禁食8～12 h后空腹靜脈采血5 ml，測定空腹血糖(FPG)(葡萄糖氧化酶法)、糖化血紅蛋白(HbA1c)(親和層析比色法)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)(顆粒增強(qiáng)免疫沉淀法)，Olympus AU-400生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，100 g饅頭餐后2 h采血測定血糖(2 h PG)(葡萄糖氧化酶法)。

1.3 方法

1.3.1 炎癥因子檢測 研究對象在清晨空腹抽取靜脈血時(shí)，另留一管5 ml血，常規(guī)分離血清(2 500 r/min，15 min)后立即放置于-20℃密封冷凍保存待測。檢測前血清自然融化，期間不曾凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清IL-17表達(dá)水平，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，板內(nèi)變異系數(shù)＜10%，板間變異系數(shù)＜15%，實(shí)驗(yàn)操作及質(zhì)量控制均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。反應(yīng)完成后30 min內(nèi)用美國Bio-Rad公司680酶標(biāo)儀測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣本中IL-17濃度。

1.3.2 頸動脈超聲多普勒檢查 采用二維超聲測定頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)?；颊呷∨P位，頸部側(cè)伸45°，用美國西門子公司sequoia全身彩超儀4～6 MHz高分辨率探頭，由同一檢查者進(jìn)行操作，掃描雙側(cè)頸動脈起始部至頸總動脈分叉1 cm處最大的IMT，明確有無頸動脈IMT和粥樣斑塊形成等改變。兩側(cè)取平均值，以IMT≥0.9 mm者為頸動脈增厚〔4〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，三組間比較用單因素方差分析。各指標(biāo)間關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，多因素分析采用多元逐步回歸法，非正態(tài)分布資料比較時(shí)取對數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)指標(biāo)比較 大血管病變組和無血管病變組SBP、FPG、2 h PG、HbA1c、hs-CRP、TC、TG、LDL-C 均高于正常對照組(P＜0.05，P＜0.01)，大血管病變組 SBP和 hs-CRP顯著高于無血管病變組(P＜0.01);BMI和HDL-C僅在大血管病變組和正常對照組比較時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;年齡、病程和DBP組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。血清IL-17表達(dá)水平在正常對照組、無血管病變組和大血管病變組中依次逐漸升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 以有無頸動脈增厚分組比較 對T2DM大血管病變患者進(jìn)行IMT測定，以有無頸動脈增厚對IL-17水平變化進(jìn)行比較，IMT在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，頸動脈增厚組IL-17水平明顯高于無頸動脈增厚組(P＜0.05)，組間性別、年齡構(gòu)成無差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組指標(biāo)比較(±s)

表1 各組指標(biāo)比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與無血管病變組比較:3)P＜0.01

指標(biāo) 正常對照組(n=68)無血管病變組(n=72)大血管病變組(n=90)男/女(n)31/37 33/39 42/48年齡(歲) 56.19±9.06 55.63±8.62 59.98±10.97病程(年) - 8.19±4.18 10.82±4.32 BMI(kg/m2) 21.45±3.12 23.86±3.45 26.14±6.431)SBP(mmHg) 117.63±14.78 130.31±13.602)141.42±16.832)3)DBP(mmHg) 77.29±9.66 79.38±11.24 81.11±9.88 FPG(mmol/L) 4.91±1.02 8.13±2.952) 8.02±2.692)2 h PG(mmol/L) 5.84±1.28 11.94±2.802) 12.61±3.362)HbA1c(%) 5.43±0.29 8.98±1.852) 9.24±1.872)hs-CRP(mg/L) 0.72±0.54 1.29±0.682) 2.41±1.192)3)TC(mmol/L) 4.43±0.98 5.16±1.171) 5.37±1.172)TG(mmol/L) 1.60±0.86 2.43±1.292) 2.54±1.372)LDL-C(mmol/L) 2.82±1.00 3.59±0.852) 3.85±1.132)HDL-C(mmol/L) 1.06±0.33 0.99±0.36 0.84±0.222)IL-17(pg/ml) 20.19±6.13 33.26±4.382) 42.49±4.892)3)

表2 無頸動脈增厚組與有頸動脈增厚組參數(shù)比較(±s)

表2 無頸動脈增厚組與有頸動脈增厚組參數(shù)比較(±s)

與無頸動脈增厚組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

指標(biāo) 無頸動脈增厚組(n=39)有頸動脈增厚組(n=51)男/女(n)18/21 24/27年齡(歲) 56.33±10.14 61.19±10.41 IMT(mm) 0.85±0.09 1.03±0.112)IL-17(pg/ml) 28.82±5.99 39.50±4.171)

2.3 IL-17與其他指標(biāo)相關(guān)性分析 大血管病變組IL-17水平與 BMI(r=0.389，P ＜0.05)、2 h PG(r=0.306，P ＜0.05)、hs-CRP(r=0.525，P ＜0.05)、TG(r=0.496，P ＜0.01)、LDL-C(r=0.617，P ＜0.01)呈正相關(guān)，與 HDL-C(r=-0.517，P ＜0.01)呈負(fù)相關(guān)，而與年齡、病程、血壓、FPG、HbA1c和TC無明顯相關(guān)性。無血管病變組IL-17與hs-CRP(r=0.431，P＜0.05)、LDLC(r=0.679，P ＜0.01)呈正相關(guān)，與 HDL(r=-0.470，P ＜0.05)呈負(fù)相關(guān)，而與其他指標(biāo)無相關(guān)性。正常對照組IL-17與各指標(biāo)均無相關(guān)關(guān)系。

2.4 多因素逐步回歸分析 以有無大血管病變(設(shè)有大血管病變?yōu)?，無大血管病變?yōu)?)為應(yīng)變量，IL-17、年齡、病程、SBP、DBP、BMI、FPG、2 h PG、HbA1c、hs-CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C為自變量，用多元逐步回歸篩選變量，按α=0.05的水平，IL-17(偏回歸系數(shù)0.261，P=0.028)、hs-CRP(偏回歸系數(shù)0.475，P=0.007)和 LDL-C(偏回歸系數(shù) 0.156，P=0.011)依次進(jìn)入方程。根據(jù)逐步回歸結(jié)果，可以認(rèn)為影響T2DM大血管病變的主要因素為IL-17、hs-CRP和HDL-C。

3 討論

糖尿病是一種以糖、脂代謝紊亂為主要特征的臨床綜合征。循證醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)，無論是1型糖尿病(T1DM)或是T2DM，高血糖均可顯著促發(fā)微血管并發(fā)癥如糖尿病腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，以及大血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、高血壓和中風(fēng)的發(fā)生〔5〕。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)異常、糖基化終產(chǎn)物生成及高糖毒性被認(rèn)為是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的高危因素，而通過調(diào)節(jié)因子增強(qiáng)炎癥信號表達(dá)觸發(fā)的血管炎癥則是涉及其中的主要事件〔6〕。已有研究表明，單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、CRP、IL-6 等均與炎癥信號傳導(dǎo)通路激活、不穩(wěn)定斑塊形成致血管功能障礙有關(guān)，尤其T細(xì)胞免疫參與了糖尿病致動脈粥樣硬化的病理過程〔7〕。Th17是一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子。在動物模型實(shí)驗(yàn)中，Th17細(xì)胞參與了自身免疫性糖尿病的發(fā)生，減少胰島局部Th17細(xì)胞的數(shù)量可以使胰島β細(xì)胞的破壞減少〔8〕。同時(shí)，有研究證明在T1DM胰島炎發(fā)生的病理過程中，IL-17和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增加〔9〕。T2DM在本質(zhì)上有類似于T1DM的發(fā)生機(jī)制，是一種免疫相關(guān)慢性炎癥性疾病。已有研究表明，在初診T2DM患者胰島素強(qiáng)化治療前后血清IL-17持續(xù)處于高水平，提示IL-17可能參與T2DM的發(fā)生發(fā)展〔10〕。

IL-17能上調(diào)或協(xié)同基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、IFN-γ及CRP表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化性疾病〔11〕。本課題組曾以高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM模型，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)IL-17表達(dá)于主動脈內(nèi)膜，以糖尿病組內(nèi)膜染色最為顯著，病變范圍更加廣泛;進(jìn)一步檢測各組大鼠主動脈IL-17蛋白及mRNA表達(dá)水平，均提示IL-17參與T2DM大血管病變的炎癥反應(yīng)過程。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上檢測T2DM患者血清IL-17水平，結(jié)果與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。2003年的歐洲高血壓治療指南將頸動脈IMT≥0.9 mm確定為內(nèi)膜中層增厚，國內(nèi)有學(xué)者亦以IMT≥0.9 mm為增厚標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為頸動脈IMT可以作為預(yù)測糖尿病患者心血管疾病的“標(biāo)志”〔12〕。本實(shí)驗(yàn)也表明IL-17與糖尿病大血管病變密切相關(guān)。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IL-17 與 BMI、2 h PG、hs-CRP、TG、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)?？梢?，在自身免疫性糖尿病患者體內(nèi)，IL-17等促炎性指標(biāo)活性明顯高于保護(hù)性因子，或者前者為致病始動因素，后者為機(jī)體代償性反應(yīng)。根據(jù)多元逐步回歸分析，可以認(rèn)為IL-17是T2DM大血管病變的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能在糖尿病大血管病變發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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