劉朝龍 王雨生，2 陳海華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，青島 266109)

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部2，青島 266109)

我國是花生的生產(chǎn)大國，年產(chǎn)花生約12 000 kt，其中花生殼約占花生果重的30%［1］，花生殼中含有65%～80%的粗纖維［2］。因其纖維素結(jié)構(gòu)中有復(fù)雜的無定形區(qū)、結(jié)晶區(qū)和微纖維［3］，尤其是結(jié)晶區(qū)不存在游離的羥基，因此要高效利用花生殼中的纖維素就必須破壞花生殼纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使纖維素易被酶解。目前，主要以物理法、化學(xué)法、生物法、聯(lián)合預(yù)處理等4大類方法對纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理［4］。單一的預(yù)處理方法通常存在較多的缺點，因而多因素聯(lián)合預(yù)處理方法的研究成為近年來的研究熱點［5－6］。其中，溫和堿氧化法是一種新興的多因素聯(lián)合預(yù)處理方法。它同時使用NaOH和H2O2，可有效去除纖維原料中的半纖維素和木質(zhì)素，釋放纖維素，提高纖維素的酶解效果［7－8］。目前盡管已有關(guān)于溫和堿氧化試劑回收及循環(huán)利用的專利［9］，但是國內(nèi)采用溫和堿氧化法處理纖維素原料的研究報道比較少見。姚秀清等［10］利用溫和堿氧化法處理脫蠟的秸稈樣品，對總糖回收率和木質(zhì)素去除率作了回歸分析，并最終確定了優(yōu)化條件。王洋等［11］采用超聲波輔助溫和堿氧化法對小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，建立了各試驗因素與處理后木質(zhì)素相對含量關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。目前尚未見到關(guān)于溫和堿氧化處理花生殼的研究報道。

我國每年有大量花生殼被廢棄，造成極大的資源浪費。若能采用溫和堿氧化法對其進(jìn)行適當(dāng)處理后酶解，可制得還原糖液，為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇或生產(chǎn)熱反應(yīng)香精提供原料，變廢為寶。

本試驗主要采用溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對花生殼進(jìn)行預(yù)處理，并對溫和堿氧化法的作用條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為花生殼纖維素的預(yù)處理方法提供理論依據(jù)，并為后續(xù)花生殼纖維素的酶解做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生殼、纖維素酶(2×104U/g):康地恩生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗設(shè)備

DELTA320pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;DHG－9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;紫外/可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溫和堿氧化處理工藝條件的單因素試驗

先將花生殼清洗3次，除去雜質(zhì)，在105℃下的干燥箱內(nèi)烘干，粉碎、過80目篩。稱取一定質(zhì)量經(jīng)清洗、除雜過的花生殼粉末，分別經(jīng)下述處理后，冷卻，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀洗滌至中性后于105℃下的干燥箱內(nèi)烘干，粉碎、過100目篩，密封保存，留待酶解。

NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對預(yù)處理效果的影響:按液固比15∶1加入質(zhì)量濃度分別為2～10 g/100 mL的NaOH溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

H2O2體積分?jǐn)?shù)對預(yù)處理效果的影響:按液固比15∶1加入體積分?jǐn)?shù)分別為1% ～5%的H2O2溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

VNaOH與VH2O2比例對預(yù)處理效果的影響:按液固比 15∶1 加入 VNaOH:VH2O2分別為 9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中攪拌處理 2.0 h。

液固比對預(yù)處理效果的影響:分別按液固比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

預(yù)處理溫度對預(yù)處理效果的影響:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，分別在 40、50、60、70、80 ℃ 水浴中攪拌處理2.0 h。

預(yù)處理時間對預(yù)處理效果的影響:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，在50℃水浴中分別攪拌處理2.0～10.0 h。

1.3.2 溫和堿氧化處理工藝條件的響應(yīng)面試驗

響應(yīng)面試驗的設(shè)計:基于單因素試驗所初步確定的溫和堿氧化處理的單因素條件，采用響應(yīng)面法在3因素、3水平上對溫和堿氧化條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗設(shè)計的因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素與水平

1.3.3 傳統(tǒng)酸法或堿法對花生殼纖維素的預(yù)處理

稱取一定質(zhì)量經(jīng)清洗、除雜的花生殼粉末，按液固比15∶1，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為1%的HCl溶液在60℃水浴中攪拌處理1.0 h，或者經(jīng)質(zhì)量濃度為8 g/100 mL的NaOH溶液在40℃水浴中攪拌處理1.0 h后，冷卻，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀洗滌至中性后于105℃下的干燥箱內(nèi)烘干，粉碎、過100目篩，密封保存，留待酶解。

1.3.4 花生殼的酶解

稱取一定質(zhì)量預(yù)處理后的花生殼粉，加入一定體積的蒸餾水，使液固比為15∶1，調(diào)節(jié)至pH 4.5，加入一定量的體積分?jǐn)?shù)為1%的纖維素酶，攪拌均勻，在50℃下酶解6.0 h，酶解結(jié)束后，進(jìn)行沸水浴滅酶20 min，使酶失活，自然冷卻，3 000 r/min離心20 min，所得上清液即花生殼酶解液。

1.3.5 酶解液還原糖含量的測定

采用DNS法［12］測定酶解液中的還原糖含量。

1.3.6 酶解率的測定

酶解率(簡稱DH)，是指酶解液中還原糖總量占酶解前樣品中纖維素總量的百分比，按如下公式計算:

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.05b軟件的多元線性回歸分析程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫和堿氧化單因素條件對預(yù)處理效果的影響

2.1.1 NaOH質(zhì)量濃度對預(yù)處理效果的影響

由圖1可以看出，隨NaOH質(zhì)量濃度的升高，花生殼纖維素酶解率顯著增加，當(dāng)NaOH質(zhì)量濃度超過8 g/100 mL后，酶解率增加緩慢。這可能是因為當(dāng)NaOH質(zhì)量濃度增大到一定水平時，NaOH對纖維素的潤脹作用接近極限，因而酶解率增加緩慢。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的NaOH質(zhì)量濃度為8 g/100 mL。

圖1 NaOH質(zhì)量濃度對花生殼酶解率的影響

2.1.2 H2O2體積分?jǐn)?shù)對預(yù)處理效果的影響

由圖2可知，隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)的升高，花生殼酶解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，H2O2體積分?jǐn)?shù)為4%，花生殼的酶解率達(dá)到最大值。這可能是因為H2O2體積分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)，能充分氧化木質(zhì)素及其降解所產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，釋放更多的纖維素，有利于纖維素酶解反應(yīng)［8］;當(dāng)H2O2體積分?jǐn)?shù)超過一定限度，可能導(dǎo)致部分纖維素氧化破壞，酶解率降低［7］。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的H2O2體積分?jǐn)?shù)為4%。

圖2 H2O2體積分?jǐn)?shù)對花生殼酶解率的影響

2.1.3 VNaOH與 VH2O2比例對預(yù)處理效果的影響

由圖3可知，隨著VNaOH與VH2O2比例的減小，花生殼酶解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)VNaOH與VH2O2比例為5∶1時，花生殼的酶解率達(dá)到最大值。當(dāng)VNaOH與VH2O2比例在一定范圍內(nèi)，NaOH的潤脹作用占據(jù)優(yōu)勢，有利于纖維素的釋放，促進(jìn)纖維素的酶解;但是，當(dāng)VNaOH與VH2O2比例的降低至某一范圍后，NaOH對纖維素的潤脹作用逐漸不明顯，H2O2作用的有限性越來越明顯，導(dǎo)致花生殼纖維素酶解率降低。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的VNaOH與VH2O2比例為 5∶1。

圖3 VNaOH與VH2O2比例對花生殼酶解率的影響

2.1.4 液固比對預(yù)處理效果的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著液固比的升高，花生殼酶解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，液固比為15∶1時酶解率達(dá)到最大值，超過25∶1后，酶解率反而會降低。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的液固比為15∶1。

圖4 液固比對花生殼酶解率的影響

2.1.5 預(yù)處理溫度對預(yù)處理效果的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著預(yù)處理溫度的升高，花生殼酶解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度在一定范圍內(nèi)(低于50℃)升高時，由于分子運動程度加劇，使得NaOH與H2O2對花生殼纖維素的預(yù)處理效果增強(qiáng);但是，隨著溫度的繼續(xù)升高，H2O2分解速率加快，使其作用減弱，因而預(yù)處理效果變差。在本試驗中，當(dāng)預(yù)處理溫度為50℃時花生殼纖維素的酶解率最高，所以溫和堿氧化處理花生殼時的適宜溫度為50℃。

圖5 預(yù)處理溫度對酶解率的影響

2.1.6 預(yù)處理時間對預(yù)處理效果的影響

由圖6可知，隨預(yù)處理時間的延長，花生殼酶解率呈現(xiàn)微弱的先上升后下降的趨勢。這可能是由于最初隨著預(yù)處理時間的延長，增加了NaOH、H2O2與木質(zhì)素半纖維素的作用時間，兩者與木質(zhì)素半纖維素充分接觸，提高了預(yù)處理效果，利于花生殼纖維素的酶解;但是隨著預(yù)處理時間的繼續(xù)延長，由于H2O2自身分解，其預(yù)處理效果減弱，使得花生殼纖維素酶解率降低［13］。當(dāng)預(yù)處理時間為2.0 h時，花生殼纖維素的酶解率達(dá)到27.57%，在2.0 h以后，預(yù)處理時間對預(yù)處理效果的提高并不明顯?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本，選擇花生殼溫和堿氧化處理的適宜時間為2.0 h。

圖6 預(yù)處理時間對花生殼酶解率的影響

2.2 預(yù)處理條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果

由表3中回歸模型及方差分析結(jié)果可知，此模型的P＜0.01，回歸模型達(dá)到極顯著水平。其中，X1、X2、X1X2、X1X3、X12、X22、X327 項 P ＜ 0.01，它們對響應(yīng)值Y的影響極顯著，其余項對Y不構(gòu)成顯著影響。失擬項各項數(shù)據(jù)表明該模型失擬不顯著，說明該回歸方程能較好的擬合真實的響應(yīng)面［14］。相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7，說明該回歸方程擬合情況非常好，能夠解釋絕大多數(shù)因變量變化。

根據(jù)試驗結(jié)果，用Design Expert 8.05b軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出酶解率與各因子之間的二次線性回歸方程為:

Y=27.41+0.556X1+2.624 X2+0.398 X3－1.243X1X2－1.145 X1X3+0.135 X2X3－1.146X12－1.88X22－1.214 X32

通過比較回歸方程一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷各因子對花生殼纖維素酶解率影響的主次性［15－17］，即花生殼預(yù)處理的過程中，處理溫度對花生殼纖維素酶解率的影響最大，其次是處理時間，最后是 VNaOH∶VH2O2。

表3 回歸模型方差分析表

圖7 VNaOH∶VH2O2與預(yù)處理溫度對酶解率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖

交互因素對花生殼纖維素酶解率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖如圖7～圖9所示。由回歸方程的偏回歸系數(shù)顯著性檢驗、交互因素的響應(yīng)曲面和等高線圖可知各因素之間的交互作用［18］，即X1(VNaOH∶VH2O2)與 X2(處理溫度/℃)之間以及 X1(VNaOH∶VH2O2)與X3(處理時間/h)存在極顯著的交互效應(yīng)(P12=0.000 1 ＜0.01，P13=0.000 2 ＜0.01)。

經(jīng)響應(yīng)面分析得出花生殼預(yù)處理的最佳工藝條件為:VNaOH∶VH2O2為 4.6∶1，處理溫度 58 ℃，處理時間2.2 h，預(yù)測的花生殼纖維素的酶解率為28.50%。在上述試驗條件下進(jìn)行驗證試驗，得到的花生殼纖維素的酶解率為28.48%，與計算機(jī)模擬值基本接近，表明預(yù)測值和真實值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗證了模型的可靠性。

2.3 溫和堿氧化法與傳統(tǒng)預(yù)處理方法效果的比較

溫和堿氧化法與傳統(tǒng)預(yù)處理方法對花生殼纖維素預(yù)處理效果的比較如表4所示。

表4 溫和堿氧化法與傳統(tǒng)預(yù)處理方法對花生殼纖維素酶解率的影響

由表4可知，溫和堿氧化法遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的酸/堿預(yù)處理方法，可以明顯提高花生殼纖維素的酶解率，進(jìn)而提高花生殼纖維素的利用率。

3 討論與結(jié)論

本試驗以花生殼為原料，采用溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對其進(jìn)行預(yù)處理，為后續(xù)酶解花生殼纖維素做準(zhǔn)備。結(jié)果表明，花生殼溫和堿氧化處理的最佳工藝條件為:VNaOH∶VH2O2為 4.6∶1，處理溫度58℃，處理時間2.2 h。在此預(yù)處理條件下花生殼纖維素的酶解率可達(dá)28.48%，遠(yuǎn)高于經(jīng)傳統(tǒng)的酸/堿預(yù)處理后花生殼纖維素的酶解率。各因素的影響主次順序為:處理溫度＞處理時間＞VNaOH∶VH2O2。

本研究突破了傳統(tǒng)方法對花生殼進(jìn)行了預(yù)處理，而不再只局限于對稻殼、秸稈等纖維素原料的研究。采用遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的酸/堿預(yù)處理方法的溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對花生殼進(jìn)行預(yù)處理，明顯提高了花生殼纖維素的酶解率，真正變廢為寶。但是，本研究中溫和堿氧化法的氧化劑并未經(jīng)過細(xì)致全面的篩選，過氧化氫是否優(yōu)于過氧乙酸等其他氧化劑有待進(jìn)一步探索。另外，本研究只是將溫和堿氧化法與傳統(tǒng)酸/堿預(yù)處理方法進(jìn)行了比較，至于其能否與微波、超聲波等物理方法相結(jié)合及結(jié)合后預(yù)處理效果如何還有待進(jìn)一步研究。

本試驗研究了溫和堿氧化法對花生殼進(jìn)行預(yù)處理的效果及條件優(yōu)化，為實現(xiàn)花生殼的再利用提供理論依據(jù)，并為工業(yè)上預(yù)處理花生殼提供參考。

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