劉 軍 徐志宏 魏振承 廖森泰 穆利霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510610)

棉籽蛋白是一種僅次于大豆蛋白的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，其營養(yǎng)價值高于禾谷類蛋白，含有小麥、稻米等谷類作物所欠缺的必需氨基酸，除蛋氨酸稍低外，其余氨基酸均達(dá)到聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦的標(biāo)準(zhǔn)［1］。但是棉籽蛋白的結(jié)構(gòu)緊密，分子質(zhì)量大，人體攝入后不易消化吸收，因而一直沒有得到充分的利用。棉籽蛋白經(jīng)水解成肽后，分子質(zhì)量減小，結(jié)構(gòu)疏松，便于人體內(nèi)酶的進(jìn)攻，吸收率大大提高［2］。因此，開發(fā)棉籽系列功能性活性肽產(chǎn)品有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。

棉籽蛋白在酶水解過程中，需要不斷加入堿液來維持反應(yīng)體系的pH值，導(dǎo)致水解液中殘留了大量的無機(jī)鹽，影響了產(chǎn)品的生物活性和性質(zhì)，也不利于對其進(jìn)一步的分析，因此有必要對酶解液進(jìn)行脫鹽純化處理，以提高棉籽多肽的生物活性。目前報道的酶解液脫鹽效果比較好的主要有001×7、201×7型陰陽離子交換樹脂、MWCO100透析袋和DA201－C型大孔吸附樹脂脫鹽。但這幾種脫鹽方法各有優(yōu)劣，對不同來源的蛋白水解液脫鹽效果也各不相同。本試驗(yàn)比較了3種具有代表性的脫鹽方法的優(yōu)劣，研究了棉籽蛋白酶解降壓肽脫鹽方法的最佳工藝，探討脫鹽純化工藝對棉籽蛋白酶解液的ACE抑制活性和氨基酸組成的影響，并對Sephadex G－25葡聚糖凝膠色譜分離純化獲得棉籽肽各組分進(jìn)行ACE抑制活性測定，確定活性組分的分子質(zhì)量分布范圍，從而為棉籽蛋白酶解制備ACE抑制活性肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉籽分離蛋白(CPI):自制，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.78%，棉酚含量 17.6 mg/kg;堿性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme):丹麥諾維信(Novozymes)公司;離子交換樹脂001×7、201×7:廣州金東方樹脂化工有限公司;MWCO100透析袋:北京中西化玻儀器有限公司;DA201－C大孔吸附樹脂:江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白、溶菌酶、VB12和L－酪氨酸:美國sigma公司。

1.2 儀器

SHA－B水浴恒溫振蕩器:常州澳華儀器有限公司;PHS－3C型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠;KDN－08A半自動凱氏定氮儀:上海新嘉電子有限公司;LD－5－A型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;UV－1800紫外可見光分光光度計(jì):島津分析儀器;5200電導(dǎo)率儀:上海自動化儀表有限公司;HL－1B數(shù)顯恒流泵:上海滬西分析儀器有限公司;SBS100數(shù)控計(jì)滴自動部份收集器:上海滬西分析儀器有限公司;Agilent 1100系列液相色譜儀:安捷倫液相色譜儀公司。

1.3 測定方法

1.3.1 含氮量的測定:微量凱氏定氮法

1.3.2 含鹽量的測定:莫爾法［3］

以K2CrO4為指示劑，用AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。由于AgCl沉淀的溶解度小于Ag2CrO4沉淀，因此溶液中首先析出AgCl沉淀，當(dāng)溶液中的氯化物與AgNO3完全作用后，過量的AgNO3立即與K2CrO4反應(yīng)生成磚紅色的Ag2CrO4沉淀，指示到達(dá)終點(diǎn)。用已知濃度的AgNO3溶液測定Cl－濃度，即可獲得氯化鈉鹽的含量，再按下式計(jì)算脫鹽率:

1.3.3 ACE 抑制率測定

參照Cushman等［4］的方法，有所修改。按照表1將各試劑加入到試管中，在37℃水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后馬上加入1 mol/L的HCl以終止反應(yīng)(樣品c需提前加入HCl);然后于各試管中加入乙酸乙酯 1.5 mL，混合后進(jìn)行離心(4 000 r/min，10 min)，吸取1 mL乙酸乙酯層于另一試管中，放入烘箱中120℃揮發(fā)溶劑35 min，拿出冷卻后加入去離子水3 mL漩渦混合后在228 nm下測定吸光值，計(jì)算公式為:

式中:Aa為ACE和ACE抑制劑同時存在的吸光值;Ab為不加抑制劑的吸光值;Ac為ACE與HHL空白反應(yīng)的吸光值。

1.3.4 氨基酸分析

采用HPLC法，樣品按GB/T 18246—2000酸水解處理，按JY/T 024—1996測定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 棉籽蛋白水解液的制備流程［5］

稱取一定量的棉籽分離蛋白(經(jīng)過脫除棉酚處理)，加水配制成懸浮液，調(diào)節(jié)體系溫度和pH至酶作用最適條件，加堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解，采用pH－stat裝置控制反應(yīng)體系的pH值在±0.05之內(nèi)，并不停的震蕩攪拌，以便水解反應(yīng)均勻、充分。反應(yīng)一段時間后再加風(fēng)味酶繼續(xù)水解一定時間，然后加熱滅酶(90℃，10 min)即得酶解液。酶解液離心(4 000 r/min，20 min)后的上清液進(jìn)行分離純化。

1.4.2 脫鹽方法

本試驗(yàn)綜合比較了3種方法對棉籽蛋白水解液進(jìn)行脫鹽:

方法1(陰陽離子交換樹脂脫鹽):將處理過的陰陽離子交換樹脂裝柱，樣品先后通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂001×7和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂201×7，用去離子水作洗脫劑，通過不同流速收集最后流出液，測定含鹽量和含氮量，計(jì)算脫鹽率和氮回收率。

方法2(透析袋脫鹽):將樣品裝入處理過的MWCO100的透析袋中，浸泡在去離子水中于4℃下透析，每4小時換一次水，24、48 h后測定水解液的含鹽量和含氮量，計(jì)算脫鹽率的氮回收率。

方法3(大孔樹脂脫鹽):樣品溶液流過DA201－C大孔吸附樹脂層析柱(2.6 cm×30 cm)，控制體積流量，檢測流出液的，以=0.05為透過點(diǎn)。試驗(yàn)中所用樣品的體積均小于透過點(diǎn)通液量，用去離子水以同樣流速洗柱至流出液的電導(dǎo)率與去離子水一致，再用75%乙醇解吸，通過不同流速收集最后流出液，減壓濃縮蒸去乙醇加去離子水定容測含氮量。計(jì)算脫鹽率和氮回收率。

脫鹽率=(水清洗液中Cl－濃度×水洗液體積)/(吸附前樣品溶液中Cl－濃度×上樣體積)×100%

氮回收率=(解吸后N濃度×定容體積)/(吸附前樣品N濃度×上樣體積)×100%

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線方程的獲得

將己知分子量標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(M r=6.7×104)、溶菌酶(M r=1.44 × 104)、VB12(M r=1.37 ×103)和L－酪氨酸(M r=181.2)配成一定濃度的溶液，經(jīng)針式微孔膜過濾后上樣過Sephadex G－25，上樣量為1.0 mL，得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫曲線。然后以分子量的對數(shù)為橫坐標(biāo)、洗脫管數(shù)(保留時間)為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫曲線方程Y=－5.364 4X+64.035(R2=0.998 5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換樹脂處理對脫鹽效果的影響

陰陽離子交換樹脂脫鹽主要是根據(jù)氨基酸與苯乙烯系強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂之間既存在離子間的靜電作用，又存在疏水作用，且二者之間存在協(xié)同作用，用水作為洗脫劑，使鹽和氨基酸得到分離［6］。此方法脫水解液中的鹽簡單易行，用水作為洗脫劑既廉價又不造成污染，樹脂再生即可重復(fù)使用。在保持室溫的條件下，考察了不同流速對脫鹽效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同流速離子交換樹脂的脫鹽效果

由圖1可知，不同的流速脫鹽對氮回收率及脫鹽率都有影響。流速越大，脫鹽率和氮回收率也隨之降低。離子交換樹脂的脫鹽率很高，但氮的回收率太低，不足10%，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。因此，選用陰陽離子交換樹脂對棉籽蛋白水解液脫鹽處理不合適。

2.2 透析對脫鹽效果的影響

考慮到棉籽蛋白水解液和鹽分之間分子質(zhì)量存在較大差異，用截留分子質(zhì)量為100 u的透析袋對水解液精致處理，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同透析時間的脫鹽效果

由圖2可知，透析時間與脫鹽率和氮回收率之間存在量效關(guān)系。透析48 h后，脫鹽率可達(dá)61.40%，此時氮回收率為51.40%。相對來說，透析脫鹽的方法簡單易行，脫鹽效果較好，但操作量小，耗時時間長，僅限于實(shí)驗(yàn)室操作，不適合工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)。

2.3 大孔吸附樹脂處理對脫鹽效果的影響

大孔吸附樹脂脫鹽是根據(jù)化合物的疏水基團(tuán)與樹脂的非極性吸附劑之間的范德華引力和靜電引力來達(dá)到分離水溶性化合物。多肽可以從水相中通過疏水作用吸附到樹脂的疏水表面和網(wǎng)絡(luò)空穴內(nèi)部，從而與鹽類分離，再通過合適濃度的乙醇洗脫就可以回收多肽［7］?？疾炝?.5、3、6 mL/min 3 種流速對脫鹽效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同流速大孔吸附樹脂的脫鹽效果

由圖3可知，流速不同對氮的回收有很大影響，流速越大，造成的氮損失越多，多肽回收率降低;流速不同對脫鹽率的影響不顯著，而且脫鹽率都在90%以上。在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中要考慮到縮短生產(chǎn)周期和較高的蛋白回收率，選用流速3 mL/min較為合適，其氮的回收率相比流速1.5 mL/min并沒有顯著降低，但周期縮短1倍，更利于工業(yè)化大生產(chǎn)，且樹脂的吸附能力沒有降低。

2.4 大孔樹脂脫鹽對棉籽蛋白ACE抑制肽的影響

用脫鹽率、氮回收率和ACE抑制率為指標(biāo)考察DA201－C大孔吸附樹脂對棉籽蛋白水解液的脫鹽效果，分析結(jié)果見表2。

表2 DA201－C樹脂脫鹽前后比較

從表2來看，流速為3 mL/min的脫鹽效果非常明顯，脫鹽率達(dá)到94.78%，氮回收率86.32%，而且脫鹽后ACE抑制率顯著提高，半抑制濃度 IC50從0.486 mg/mL 下降到0.328 mg/mL。

2.5 大孔樹脂脫鹽對棉籽蛋白水解液氨基酸組成的影響

對脫鹽前后的棉籽蛋白酶解液進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，棉籽蛋白水解液中含有豐富的 Asp，Glu，Arg，Phe，Leu 等必需氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白肽。經(jīng)過DA201－C大孔吸附樹脂處理后，水解液中的 Tyr，Phe，Ile，Leu，Lys等疏水性氨基酸得到了有效富集，這是因?yàn)椴糠钟H水性氨基酸未完全被大孔樹脂吸附而流失［8］，而具有吲哚環(huán)的Try(未檢測)或苯環(huán)的Tyr和Phe可以被樹脂強(qiáng)烈吸附，具有較長脂肪族側(cè)鏈的氨基酸Leu、Ile和具有琉基的Met(含量太低)也可被充分吸附［9］，從而使得疏水性氨基酸得到了富集，脫鹽后疏水性氨基酸大幅度增加，其總和所占比例是脫鹽前的近2倍。

ACE抑制活性肽都含有豐富的疏水性氨基酸［10］。棉籽多肽中含有較多的疏水性肽段，因而其具有很好的ACE抑制活性，而且這些疏水型氨基酸能很好地被DA201－C大孔吸附樹脂吸附而得到富集，從而進(jìn)一步提高了棉籽蛋白水解液的ACE抑制活性。

表3 棉籽蛋白水解液脫鹽前后的氨基酸組成分析/mg/g蛋白質(zhì)

從表3還可以看出，脫鹽后水解液中Tyr和Phe含量增幅最大，達(dá)到2倍以上，這正符合ACE抑制活性肽模型相符［11］，該模型認(rèn)為疏水性氨基酸殘基占60%以上，且末端的氨基酸種類如果是芳香族氨基酸或疏水性氨基酸殘基，則與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶結(jié)合能力強(qiáng)，降壓活性高，這也是棉籽蛋白水解液脫鹽后ACE抑制活性提高的另一個原因。

2.6 Sephadex G－25分離純化ACE抑制肽

凝膠過濾層析技術(shù)可分離分子質(zhì)量大小不同的蛋白質(zhì)并測定其分子質(zhì)量。Sephadex G－25分離范圍是1 000～5 000 u，適用于脫鹽、肽與其他小分子的分離。對脫鹽后的棉籽蛋白水解液采用Sephadex G－25分離純化，如圖4所示:共有7個峰出現(xiàn)，前面的3個峰屬于蛋白峰，不予以考慮。將后4個峰依次命名為峰Ⅰ(39～43管)、峰Ⅱ(44～49管)、峰Ⅲ(50～54管)和峰Ⅳ(55～61管)，可以分成4個組分。同時可以看出，棉籽蛋白酶解物分子質(zhì)量是連續(xù)分布的，即水解物中存在著各種大小不等的肽分子，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫曲線方程可知大部分棉籽肽分子質(zhì)量分布在13 000 u以下。

圖4 棉籽蛋白酶解物的凝膠過濾層析洗脫圖

2.7 各組分的ACE抑制活性比較研究

把收集到的各管洗脫液按各組分合并，定量后比較ACE活性的抑制率，結(jié)果如圖5。由圖5可知，各組分對ACE的抑制率差異較大。組分Ⅲ的抑制率最高，達(dá)到83.63%，其次是組分Ⅱ，為62.75%，最差的是組分Ⅰ和Ⅳ，分別為32.81%和28.52%，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫曲線方程粗略發(fā)現(xiàn)，組分Ⅲ的分子質(zhì)量小于1 ku，說明小分子質(zhì)量的棉籽短肽的ACE抑制活性最高，這與Miguel等［12］的結(jié)論是一致的。

圖5 各組分的ACE抑制活性

3 結(jié)論

3.1 大孔吸附樹脂對棉籽蛋白水解液脫鹽簡單可行，在流速為3 mL/min時，脫鹽率可達(dá)到94.78%，氮回收率為86.32%;比較脫鹽前后的疏水性氨基酸變化，發(fā)現(xiàn)脫鹽后疏水性氨基酸(特別是Tyr和Phe)得到有效富集，ACE抑制率顯著提高，半抑制濃度IC50從0.486 mg/mL 下降到 0.328 mg/mL。由于大多數(shù)的生理活性肽的生理活性都與其疏水性有關(guān)，因而采用DA201－C大孔吸附樹脂吸附脫鹽可望成為一種有效分離純化活性肽的方法。

3.2 DA201－C大孔吸附樹脂脫鹽純化后疏水性氨基酸得到了有效富集，ACE抑制率顯著提高。分離純化后的ACE抑制肽各組分中，組分Ⅲ的抑制率最高，分子質(zhì)量小于1 000 u的短肽。

［1］劉大川.植物蛋白工藝學(xué)［M］.中國商業(yè)出版社，1993:17－19

［2］郭城，鄭竟成.酶法水解棉籽蛋白的研究［J］.中國油脂，2007，32(8):38 －40

［3］劉大川，周俊梅.富硒菜籽蛋白肽的精制研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(1):129 －133

［4］Cushman D W，Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin－converting enzyme of rabbitlung［J］.Biochemical Pharmacology，1971，20:637 －648

［5］劉軍.棉籽蛋白的制備及其酶解物抗氧化與ACE抑制活性的研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009

［6］劉菊湘，劉國棟，閻虎生，等.用離子交換樹脂脫除氨基酸與鹽混合液中的鹽［J］.離子交換與吸附，2000，l6(6):521－527

［7］趙一明，王璋，許時嬰，等.大孔吸附樹脂對酪蛋白非磷膚脫鹽效果的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(11):22－25

［8］Cristina M，Justo P，Mariadel M Y.Purification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from sunflower protein hydrolysates by reverse－phase chromatography following affinity purification［J］.LWT － Food Science and Technology，2009，42:228 －232

［9］Gordon C.Removal of salts from aromaticamino acids，their metabolites and related compounds using an xad－4 resin［J］.Journal of Chromatography 1986，355:193 －200

［10］Meisel H.Overview on milk protein － derived peptides［J］.International Dairy Journal，1998，8:363 －373

［11］Cheung H S，Wang F L，Ondetti M A，et al.Binging of peptide substrates and inhibitors of angiotensin－converting enzyme importance of the COOH－terminal dipetide sequence［J］.The Journal of Biological Chemistry，1980，25:401 －407

［12］Miguel M，Contreras M M，Recio I，Aleixandre A.ACE － inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate.Food Chemistry，2009，112:211 －214.