杜玉然， 賀福元，2*， 鄧俊林， 雷 虹， 包小燕， 謝相貴

(1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208;2．中藥藥性與藥效國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208)

中藥材在自然界空氣、水、無(wú)機(jī)鹽、陽(yáng)光等生物環(huán)境因素的影響下，經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化形成了穩(wěn)定的物種，具有遺傳多態(tài)性［1］。其生長(zhǎng)發(fā)育可看成為在初生、次生代謝酶體系特別是CYP450家族酶的作用下，將初生態(tài)外源性成分有序生化代謝成次生態(tài)內(nèi)源性成分的綜合過(guò)程。因此中藥材作為多成分的有機(jī)整體其成分間具有同母核群生性的特點(diǎn)［2］。紅花藥材在全國(guó)多省份均有生產(chǎn)，由于地理環(huán)境因素的影響，微觀狀態(tài)為母核衍化的群生化合物種類及含有量不同，宏觀表現(xiàn)為紅花質(zhì)量的參差不齊，這就給紅花藥材建立完整質(zhì)量控制方法提出了難題。

本課題組已提出的“網(wǎng)通虹勢(shì)”代謝規(guī)律，即藥材同母核群生性成分間代謝“網(wǎng)通”［3］，可以相互轉(zhuǎn)化，另外根據(jù)生物物理學(xué)原理，中藥材生長(zhǎng)發(fā)育遵循熱力學(xué)守恒定律，成分間化學(xué)勢(shì)整體維持平衡如虹吸現(xiàn)象 (此消彼長(zhǎng)，總量不變)［4］。本研究以“網(wǎng)通虹勢(shì)”為原理依據(jù)，針對(duì)不同產(chǎn)地紅花藥材，以生物熱力學(xué)為理論依據(jù)，創(chuàng)立紅花藥材的熱力學(xué)狀態(tài)函數(shù)，研究紅花宏觀狀態(tài)參數(shù)與虹勢(shì)性規(guī)律的關(guān)系，為構(gòu)建宏觀狀態(tài)函數(shù)與微觀成分濃度相統(tǒng)一的中藥化學(xué)質(zhì)量控制體系提供模型及數(shù)據(jù)參考［5］。

1 原理

本課題組提出中藥材的多態(tài)性與成分的多樣性可用遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)與理論生物物理學(xué)進(jìn)行研究，建立起微觀成分指紋圖譜信息與宏觀狀態(tài)函數(shù)數(shù)學(xué)模型［6］。中藥材成分宏觀質(zhì)量參數(shù)體系包括表觀平衡常數(shù)、燃燒焓、信息熵、信息量、生物熵，其中燃燒焓、信息熵、生物熵及表觀平衡常數(shù)反映中藥材不同遺傳狀態(tài)的性質(zhì)參數(shù)，而信息量反映其量變的程度參數(shù)。公式推導(dǎo)詳見(jiàn)本課題組文獻(xiàn)［7］，應(yīng)用公式列舉如下:在初生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的條件下，表觀平衡常數(shù)K'為K'=，式中ai為次生態(tài)i成分濃度，初生態(tài)s成分濃度。信息熵Sie為Sie=其中C為常數(shù)。信息量Siq為Siq為特征峰的總面積，W0為對(duì)應(yīng)的總質(zhì)量。生物熵

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器 電子天平CP114(上海奧豪斯儀器有限公司)，SK2200HP型數(shù)控超聲儀 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，HH—4智能數(shù)顯恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DRF—6050型真空干燥箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);安捷倫高效液相色譜儀，Agilent 1200色譜分析工作站，Agilent UV檢測(cè)器，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器。

2.1.2 試藥 羥基紅花黃色素A對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所 (批號(hào)111637～200905，供含量測(cè)定用，規(guī)格20 mg)。13份不同產(chǎn)地紅花藥材分別來(lái)自S1四川、S2內(nèi)蒙古、S3江西、S4云南、S5浙江、S6安徽、S7吉林、S8山西、S9河北、S10廣西、S11新疆、S12河南、S13西藏，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶老師鑒定為菊科Carthamus tinctorius L．的干燥花。用60℃真空干燥箱干燥，備用。超純水 (實(shí)驗(yàn)室自制)，乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純。

2.2 紅花水溶性浸出物指紋圖譜的建立［8］參考2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄ⅩA記載水溶性浸出物冷浸法測(cè)定。

2.2.1 羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量制備成0.625 mg/mL的溶液，加入超純水超聲溶解，定容至2 mL量瓶，即為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別稱取不同省份的紅花供試藥材10 g分別置于13個(gè)500 mL三角錐形燒瓶中，分別量取250 mL蒸餾水浸潤(rùn)30 min，85℃水浴浸提30 min，趁熱抽濾，再分別加入250 mL蒸餾水85℃水浴浸提30 min，抽濾，合并兩次濾液，得到13份不同產(chǎn)地紅花水提液。分別取2 mL不同產(chǎn)地的紅花水提液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾至自動(dòng)進(jìn)樣瓶，供測(cè)定指紋圖譜使用。其他水提液分別水浴濃縮，真空干燥，得13份干燥樣品，供測(cè)定燃燒焓使用。

2.2.3 色譜條件 UtimateTM AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5μm);柱溫30℃;流動(dòng)相為0.2%磷酸-乙腈梯度洗脫，0 min(97∶3)→12 min(90∶10)→32 min(84∶16)→62 min(73∶27)→70 min(97∶3);體積流量1 mL/min(12 min為0.8 mL/min);進(jìn)樣量10μL。檢測(cè)條件:Agilent 1200高效液相色譜儀 (包括G1311A四元泵、G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、G1329A自動(dòng)控溫的自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent LC色譜工作站)。

圖1 紅花水提物HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of water extracts from Carthamus tinctorius

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按上述色譜條件對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液以及超純水空白液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1。理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素計(jì)算均不低于3 000，分離度均大于1.0。陰性對(duì)照品圖中無(wú)干擾峰存在。在0.125～12.5μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，儀器的精密度良好，樣品在30℃條件下24 h基本穩(wěn)定，樣品制備方法具有可重復(fù)操作性。

2.2.5 全國(guó)13產(chǎn)地指紋圖譜的建立 按上述色譜條件對(duì)各樣品進(jìn)針，得到指紋圖譜，見(jiàn)圖2。

圖2 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint chromatogram of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

2.3 燃燒焓的測(cè)定［9］在測(cè)量?jī)x器的內(nèi)筒中準(zhǔn)確加入3 000 mL蒸餾水。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物苯甲酸2片 (共1.001 6 g)置于燃燒皿中，將燃燒皿放于氧彈中，取約6 cm長(zhǎng)鎳鉻絲安裝好 (注意鎳鉻絲不能與燃燒皿接觸可與藥物接觸)，擰緊氧彈。在3.0 MPa下向氧彈中充入足夠氧氣，安裝好電極，置于內(nèi)筒蒸餾水中，檢查無(wú)漏氣后，放好桶蓋點(diǎn)火，開(kāi)始記錄顯示器上溫度的變化 (溫度上升)，待溫度首次下降為終點(diǎn)停止記錄。終點(diǎn)完成時(shí)仔細(xì)觀察彈筒和燃燒皿無(wú)殘留，保證燃燒完全［10］。若有不完全跡象，稱出未燃燒完的鎳鉻絲質(zhì)量，經(jīng)溫度矯正計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)熱容量 (詳細(xì)參考HR3000數(shù)顯熱量計(jì)使用說(shuō)明)。同樣方法連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)熱容量為140 561.267 1 J/K，溫度升高相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差 (relative standard deviation，RSD)小于2.00%，說(shuō)明儀器精密度好。藥物提取物預(yù)先干燥，準(zhǔn)確稱定1.0 g于燃燒皿中，具體操作方法同標(biāo)準(zhǔn)苯甲酸熱焓測(cè)定，計(jì)算公式如下:

上述公式中ΔT、T校正均為溫度，單位為℃，ΔT試驗(yàn)中測(cè)得，T校正按0.005 3計(jì)算，Q點(diǎn)火絲按120 J計(jì)算，M為實(shí)驗(yàn)所稱量樣品質(zhì)量，單位為g。

3 結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

3.1 紅花水提物的燃燒焓 按2.3項(xiàng)測(cè)得溫度差，代入公式求得，見(jiàn)表1。

表1 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物燃燒焓Tab.1 Combustion enthalpies of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

由表1可知，全國(guó)13產(chǎn)地購(gòu)置的紅花水提物的燃燒焓均在－14 861與－16 006 J/g范圍內(nèi)，其RSD為2.235%，說(shuō)明13產(chǎn)地紅花水提物燃燒焓穩(wěn)定，在能量守恒定律基礎(chǔ)上，各地紅花宏觀生物熱基本一致。

3.2 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物樣品液指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

3.2.1 全國(guó)13產(chǎn)地紅花指紋圖譜總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)［11］參考本課題組原積分條件［8］，最小半峰寬0.20 min、最小峰面積15 000μV/s、最小峰高1 000μV，13產(chǎn)地紅花指紋圖譜得到總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)Tab.2 Total quantum statistical parameter of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.2 全國(guó)13產(chǎn)地紅花指紋圖譜相似度 按中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版計(jì)算得指紋圖譜的相似度，見(jiàn)表3。

表2與表3數(shù)據(jù)分析，總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)及相似度可以反映不同產(chǎn)地紅花的穩(wěn)定性與差異性?？偭拷y(tǒng)計(jì)矩參數(shù)是對(duì)紅花指紋圖譜微觀信息的體現(xiàn)，零階矩AUCT為指紋圖譜峰面積之和，13產(chǎn)地AUCT的RSD為22.74%，說(shuō)明不同產(chǎn)地紅花質(zhì)量存在差異性。相似度范圍為0.037～0.962，其中相似度小于0.5的占38.20%，再次證明不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜微觀表征具有差異性，群體不穩(wěn)定，全國(guó)13產(chǎn)地的紅花藥材質(zhì)量參差不齊。

表3 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物指紋圖譜相似度Tab.3 Fingerprint chromatogram's sim ilarity of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.3 全國(guó)13產(chǎn)地紅花指紋圖譜信息熵、信息量及混雜平衡常數(shù)全指紋圖譜結(jié)果見(jiàn)表4，24特征峰成分結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物信息熵 (量)、生物熵及表觀平衡常數(shù)Tab.4 In formation entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

表4～表5數(shù)據(jù)分析一，全指紋圖譜信息熵范圍 (3.934～5.783)，其 RSD為8.35%，24特征峰的信息熵范圍 (3.316～4.373)，其 RSD為6.18%，說(shuō)明全國(guó)13產(chǎn)地紅花藥材信息熵相對(duì)穩(wěn)定，單位成分的混雜度小。

全指紋圖譜信息量波動(dòng)范圍較大(7.793×107～3.195 ×108μV·s/g)，其 RSD 為 38.02%;24成分的信息量(6.569×107～1.599×108μV·s/g)，其RSD為23.56%。上述數(shù)據(jù)說(shuō)明全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物的信息量是不穩(wěn)定的，即指紋圖譜具有較高的混雜靈敏度，受到某方面影響后極易表現(xiàn)出信息熵的不穩(wěn)定，出現(xiàn)較高的混雜度。故信息熵可用于生物熵的計(jì)算，而信息量不能用于生物熵［12］的計(jì)算，可用作指紋圖譜的分析。

表4～表5數(shù)據(jù)分析二，全指紋圖譜生物熵均在－83.46～－147.9 J/K之間，RSD為－14.36%。特征峰生物熵波動(dòng)范圍在－63.02與－79.8 J/K之間，其RSD為－6.208%。整體看來(lái)紅花水提物的生物熵具有穩(wěn)定性，宏觀質(zhì)量表征穩(wěn)定。特征峰生物熵的穩(wěn)定性優(yōu)于全指紋圖譜。表觀平衡常數(shù)全指紋圖譜算得0.033 8～0.103 4，其RSD為32.65%;24特征峰指紋圖譜的表觀平衡常數(shù)0.048 3～0.100 4，其RSD為21.25%。上述數(shù)據(jù)說(shuō)明全國(guó)各地紅花水提物的表觀平衡常數(shù)不同，不同地方的氣候不同，產(chǎn)生各成分的種類不同。

4 討論

中藥指紋圖譜作為中藥多成分質(zhì)量控制分析體系，只能對(duì)微觀成分量變進(jìn)行簡(jiǎn)單描述，具有一定的局限性。因此從原植物生物學(xué)屬性角度結(jié)合紅花指紋圖譜探討紅花各成分的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性，在原有的指紋圖譜信息的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)變?yōu)樾畔㈧睾托畔⒘?。再結(jié)合信息熵與平衡常數(shù)，平衡常數(shù)與Gibbs自由能的關(guān)系，建立起生物熱焓、生物熵的紅花多成分宏觀質(zhì)量控制狀態(tài)函數(shù)模型，其能夠全面準(zhǔn)確地揭示紅花質(zhì)量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為中藥質(zhì)量控制提供參考。

表5 全國(guó)13產(chǎn)地紅花水提物24特征峰燃燒焓、信息熵 (量)、生物熵及表觀平衡常數(shù)Tab.5 Combustion enthalpies，information entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts＇24 characteristic peaks of Carthamus tinctorius from the national 13 p rovinces

4.1 峰面積與燃燒焓方差分析 燃燒焓是紅花生物能熱量的宏觀狀態(tài)表征，指紋圖譜是紅花各成分群的微觀含量表征。各按SPSS 16.0操作，將燃燒焓 (因變量)與24個(gè)特征峰 (自變量)經(jīng)方差分析，F(xiàn)=11.765，P=0.002線性回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明各特征峰燃燒焓具有疊加性，可通過(guò)疊加計(jì)算總?cè)紵?，宏觀與微觀具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.2 全指紋圖譜與特征峰的比較 紅花指紋圖譜的特征峰可看做是紅花主要成分群。比較表4與表5數(shù)據(jù)，可得全成分信息熵、信息量、生物熵及表觀平衡常數(shù)的RSD均大于主成分群，說(shuō)明主成分群的穩(wěn)定性更高，且混雜靈敏度小，不易出現(xiàn)混雜現(xiàn)象。生物熵更加穩(wěn)定，全國(guó)紅花主成分宏觀質(zhì)量表征具有共通性。整體體現(xiàn)了全國(guó)13產(chǎn)地紅花藥材主成分的相似性，全成分的差異性。猜想不同產(chǎn)地紅花基礎(chǔ)藥效相同，可能與主成分穩(wěn)定相關(guān);不同產(chǎn)地紅花又有優(yōu)劣之分，可能與全成分種類、含量差異有關(guān)。

綜上所述，紅花中藥材的水提物有穩(wěn)定的燃燒焓、信息熵及生物熵，宏觀狀態(tài)穩(wěn)定。不同產(chǎn)地紅花其指紋圖譜微觀表征具有差異性，多成分之間代謝體現(xiàn)“虹勢(shì)性”，不同地方的信息量、表觀平衡常數(shù)體現(xiàn)“道地性”。虹勢(shì)性體現(xiàn)了藥材中各成分之間的轉(zhuǎn)化是控制宏觀的藥材代謝作用方向，道地性體現(xiàn)了在宏觀作用下調(diào)節(jié)的精確作用。因此中藥成分質(zhì)量是微觀各成分質(zhì)量與宏觀成分群組合模式質(zhì)量的統(tǒng)一。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)遺傳多態(tài)性、生物物理學(xué)燃燒焓原理，結(jié)合現(xiàn)有的指紋圖譜質(zhì)量評(píng)估方法，首次建立紅花的信息熵、信息量、生物熵及表觀平衡常數(shù)數(shù)學(xué)模型，為本課題組“網(wǎng)通虹勢(shì)”理論提供實(shí)例支持，為紅花質(zhì)量控制注入新的數(shù)學(xué)理念。

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