李莎莎， 程 亮， 危紅華， 宋艷麗， 韓騰飛， 鞠大宏， 趙宏艷， 郝保華*

(1.西北大學生命科學學院，陜西西安710069;2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京100700)

鹽酸青藤堿 (sinomenine hydrochloride)具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和免疫抑制作用，主治類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，臨床療效確切［1-2］。有研究表明［3-4］，鹽酸青藤堿的鎮(zhèn)痛作用有兩方面，一方面作用于外周，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，一方面作用于中樞，發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用。但是由于其半衰期短，代謝快，口服給藥有嚴重的胃腸道副反應(yīng)，限制了它的利用［5］。

固體脂質(zhì)納米粒 (solid lipid nanoparticles)是20世紀90年代中期興起的一種新型納米粒載藥系統(tǒng)，具有可控制藥物釋放、避免藥物泄露以及良好的靶向性等特點［6］，又兼具脂質(zhì)體、微乳等毒性低、能大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦徒o藥系統(tǒng)［7-9］，固體脂質(zhì)納米粒的這些優(yōu)點彌補了鹽酸青藤堿口服給藥的缺陷。本實驗采用高溫乳化-低溫固化法制備鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，以單硬脂酸甘油酯和卵磷脂為載體材料，以泊洛沙姆和聚山梨酯－80為表面活性劑［10］。同時也研究了兩種不同給藥方式下固體脂質(zhì)納米粒對鹽酸青藤堿藥動學和藥效學的影響，為安全、高效、方便利用鹽酸青藤堿的鎮(zhèn)痛作用提供參考。

1 材料與儀器

恒溫磁力攪拌器 (江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);FJ—200高速分散勻質(zhì)機 (上海標本模型廠);YP—5001電子天平 (上海良平儀器儀表有限公司);高效液相色譜儀 (1525型泵，2487型檢測器，Waters公司);TGL—16B離心機 (上海安亭科學儀器有限公司);RCY—2型熱板測痛儀(上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司)。

鹽酸青藤堿 (質(zhì)量分數(shù)≥98.5%，西安小草植物科技有限公司);單硬脂酸甘油酯 (上海山浦化工有限公司);卵磷脂 (天津市科密歐化學試劑研發(fā)中心);泊洛沙姆188(德國BASF公司);聚山梨酯－80(藥用級，成都市科龍化工試劑廠);甲醇為色譜純，其余均為分析純，水為蒸餾水。

昆明種小鼠 (雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g)，SD大鼠 (體質(zhì)量180～220 g)，許可證號:SCXK(軍)2007－007，均由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃干燥至恒定質(zhì)量的鹽酸青藤堿2.5 mg，加流動相溶解并定容至50 mL棕色量瓶中，配得質(zhì)量濃度為50 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2 樣品處理［11］

2.2.1 血樣的處理 將0.2 mL血樣加入涂有肝素鈉的離心管中，8 000 r/min離心后取50μL血漿置于10 mL試管中，加入0.5 mL氫氧化鈉 (0.1 mol/L)混勻，再加入5 mL三氯甲烷渦旋5 min，3 000 r/min離心分離三氯甲烷后按上述步驟重復提取一次，合并三氯甲烷液，于55℃下將溶劑蒸干，殘余物用0.1 mL流動相溶解，取20μL進樣，記錄色譜圖和峰面積。

2.2.2 腦組織的處理 取大鼠腦組織，剝離表面血管并用濾紙吸凈血跡，稱定質(zhì)量，加入3倍量的生理鹽水，使用組織勻漿機勻漿5 min，精密吸取組織勻漿液200μL于1.5 mL離心管中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉1.0 mL，4 500 r/min離心10 min，取上清液500μL于10 mL試管中，加入5 mL三氯甲烷渦旋5 min，靜置分離三氯甲烷后重復提取一次，合并三氯甲烷液，于55℃下將溶劑蒸干，用0.1 mL流動相溶解，取20μL進樣。

2.3 HPLC法測定鹽酸青藤堿［12-13］

2.3.1 色譜條件 ODSC18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為甲醇-磷酸二氫鈉 (0.01 mol/L)-乙二胺 (體積比為55∶45∶0.25)，體積流量0.8 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長263 nm，進樣體積為20μL。

2.3.2 標準曲線的繪制 用甲醇將上述配制好的鹽酸青藤堿對照品貯備液依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL的對照品溶液，取空白血漿和腦組織勻漿液各1 mL，然后分別加入上述配制好對照品稀釋液，得到一系列含鹽酸青藤堿分別為50、40、20、10、0.4、0.2、0.1μg/mL的溶液。按照2.2項下操作處理上述樣品，再按照2.3.1項下操作，以待測物質(zhì)量濃度C為橫坐標，以對照品的峰面積A為縱坐標進行回歸運算，得標準曲線方程，如表1。

表1 鹽酸青藤堿的標準曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Tab.1 Standard curves，correlation coefficients，linear ranges of sinomenine hydrochloride

鹽酸青藤堿對照品、空白輔料、空白血漿、空白腦組織、含藥血漿、含藥腦組織的色譜如圖1所示。

圖1 含藥標準品 (A)、空白納米粒 (B)、空白血漿 (C)、空白腦組織 (D)、含藥血漿 (E)、含藥腦組織 (F)的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of sinomenine hydrochloride standard(A)，blank solid lipid nanoparticles(B)，blank blood(C)，blank brain tissue(D)，blood sam ple of sinomenine hydrochloride(E)，brain tissue sample of sinomenine hydrochloride(F)

2.3.3 方法學考察 精密度與回收率實驗取不同質(zhì)量的鹽酸青藤堿貯備液分別加入1 mL空白固體脂質(zhì)納米粒和1 mL空白血漿中，使鹽酸青藤堿質(zhì)量濃度分別為10、20、40μg/mL，按2.3.1項方法操作，每一質(zhì)量濃度進樣6次，計算其回收率及及精密度，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸青藤堿的回收率和精密度(±s，n=6)Tab.2 Recoveries and precisions of sinomenine hydrochloride(±s，n=6)

表2 鹽酸青藤堿的回收率和精密度(±s，n=6)Tab.2 Recoveries and precisions of sinomenine hydrochloride(±s，n=6)

類型 質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) 回收率/% RSD/%固體脂質(zhì)納米粒 40 98.3±1.21 1.68固體脂質(zhì)納米粒 20 99.8±1.40 1.43固體脂質(zhì)綱米粒 10 102.8±1.22 1.26大鼠血漿 40 95.3±1.08 1.65大鼠血漿 20 96.8±1.42 1.86大鼠血漿10 99.3±1.14 2.42

2.4 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的制備

2.4.1 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的制備［14］稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、卵磷脂，加熱至75℃使熔融，作為油相。取處方量泊洛沙姆、聚山梨酯－80加入75℃水中，在攪拌條件下加入處方量的鹽酸青藤堿，并攪拌使分散均勻，作為水相。在恒溫磁力攪拌器作用下，將油相趁熱滴加到同溫度水相中，利用高速分散勻質(zhì)機勻質(zhì)10 min，用0.22μm微孔濾膜過濾，即得乳白色鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒膠體分散液。同法制備不含鹽酸青藤堿的固體脂質(zhì)納米粒，作為空白對照。

2.4.2 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的質(zhì)量評價［15］

2.4.2.1 形態(tài)觀察 取鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒適量，加適量的蒸餾水稀釋后滴加至覆蓋銅網(wǎng)的碳膜上，用磷鎢酸復染色法復染，置于激光透射電子顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)，測定結(jié)果可知鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒呈球形或橢球形，外觀圓整規(guī)則，分散性好。結(jié)果見圖2。

2.4.2.2 粒徑分布 另取鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒適量，用適量的蒸餾水稀釋后置于激光動態(tài)散射儀的樣品管中測定其粒徑及分布。由測定結(jié)果可知鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的平均粒徑為(145.3±7.2)nm，其分散性指數(shù)為 0.091±0.016，與激光透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果基本吻合。結(jié)果見圖3。

圖3 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of sinomenine hydrochloride solid lipid nanoparticles

2.4.2.3 包封率和載藥量 精密量取鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒溶液1 mL，以30 000 r/min的速度離心60 min，對鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒溶液進行游離藥物和納米粒的分離，精密量取上清液適量，加甲醇稀釋至一定倍數(shù)，取20μL上述溶液，按2.3.1項測定其游離藥物的量。

精密量取鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒溶液1 mL，直接加甲醇破乳，并超聲提取，精密量取破乳后溶液，加甲醇稀釋至一定倍數(shù)，取20μL上述溶液，按2.3.1項測定其總藥物含有量。按下列公式計算，得出包封率和載藥量，結(jié)果見表3。

包封率=［(m總－m游)/m總］×100%

載藥量=［(m總－m游)/m質(zhì)］×100%

式中m總表示藥物總量，m游表示未包封于納米粒中游離的藥物，m質(zhì)表示含藥納米粒的總質(zhì)量。

表3 3批鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒包封率和載藥量Tab.3 Encapsulation efficiency and drug loading of sinomenine hydrochloride solid lipid nanoparticles

2.5 體外釋放度測定 以去離子水為溶出介質(zhì)，分別精密量取鹽酸青藤堿水溶液和鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米?；鞈乙焊? mL于透析袋中，放入37℃200 mL溶出介質(zhì)中。分別在0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0 h取釋放液1 mL，過0.22μm濾膜，進行HPLC測定，同時補充同溫度的溶出介質(zhì)1 mL。測定鹽酸青藤堿質(zhì)量濃度，計算累計釋放率。以時間 (min)為X軸，以累積釋放率 (%)為Y軸繪制釋放曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 鹽酸青藤堿累積釋放曲線Fig.4 In vitro release curves of sinomenine hydrochloride

從圖4可以看出，鹽酸青藤堿水溶液釋放在2 h達到平臺期，即能完全釋放，累積釋放為(93.5±0.4)%。鹽酸青藤堿從納米粒中釋放2 h的累積釋放量為44.6%，表現(xiàn)出明顯的緩釋性;0～4 h釋放速度較快，8 h以后進入平臺期，趨于平緩，48 h累積釋放量為 (88.3±0.6)%。說明鹽酸青藤堿納米粒緩釋性優(yōu)于鹽酸青藤堿溶液，有很好的緩釋作用。

2.6 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒體內(nèi)藥-時曲線的測定 將12只大鼠隨機分成4組，每組3只，其中兩組為尾靜脈注射組，另外兩組為經(jīng)皮給藥組。實驗前禁食14 h，經(jīng)皮給藥組大鼠脫去背部2.0 cm×2.0 cm毛，分別涂抹鹽酸青藤堿溶液和鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒 (涂抹量為40 mg/kg)，尾靜脈注射組分別按照鹽酸青藤堿10 mg/kg的劑量分別尾靜脈注射鹽酸青藤堿溶液和鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，在給藥 0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 h分別對各組大鼠眼眶靜脈叢取血0.2 mL，按照2.2.1項方法操作，計算血液中藥物濃度。藥-時曲線結(jié)果見圖5。尾靜脈注射兩種制劑后，固體脂質(zhì)納米粒組藥物在血漿中的分布較水溶液組有明顯提高了血藥濃度的可維持時間。4 h時，注射鹽酸青藤堿水溶液已檢測不到藥物，而注射鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的還能保持一定的血藥濃度。

圖5 鹽酸青藤堿不同給藥方式的藥-時曲線Fig.5 Concentration-time curve of sinomenine hydrochloride with different adm inistration in rats

2.7 鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒對大鼠鎮(zhèn)痛作用研究

2.7.1 中樞鎮(zhèn)痛藥效的研究 對藥物中樞鎮(zhèn)靜止痛藥效研究常采用小鼠熱板痛閾法［16-17］，操作如下:取體質(zhì)量20 g左右的雌性小鼠，置于加熱至(55±0.5)℃的熱板上測定其痛閾值，以舔后足為指標，每只測2次，間隔5 min，取其平均值作為正常痛閾值，選擇痛閾值不超過30 s的小鼠。結(jié)果見表4。

表4 鎮(zhèn)痛實驗(n=4，±s)Tab.4 Analgesic efficacy of sinomenine hydrochloride(n=4，±s)

表4 鎮(zhèn)痛實驗(n=4，±s)Tab.4 Analgesic efficacy of sinomenine hydrochloride(n=4，±s)

注:與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別靜脈注射20 min后 經(jīng)皮2 h后疼痛次數(shù)/次扭體次數(shù)/次疼痛次數(shù)/次扭體次數(shù)/次生理鹽水 22.3±4.7 30.6±3.4 22.8±5.3 31.8±1.7空白－固體脂質(zhì)納米粒22.7±3.4 30.9±2.6 22.1±2.3 31.6±0.9含藥水溶液 36.7±3.1* 23.7±4.9* 28.2±2.7* 18.2±6.7*含藥－固體脂質(zhì)納米粒 45.3±3.9＊＊ 15.4±4.1＊＊ 33.4±2.0* 10.3±4.6＊＊

靜脈注射組將32只小鼠，隨機分成4組，每組8只，分別尾靜脈注射生理鹽水，空白固體脂質(zhì)納米粒，鹽酸青藤堿溶液，鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，給藥劑量為10 mg/kg，20 min后測各小鼠的痛閾值。立即處死小鼠取其腦組織，按2.2.2項下操作，測其腦組織中鹽酸青藤堿含有量。

經(jīng)皮給藥組取32只雌性小鼠，隨機分為4組，每組8只，脫去背部2.0 cm×2.0 cm毛，分別涂抹生理鹽水、空白固體脂質(zhì)納米粒、鹽酸青藤堿溶液、鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，給藥劑量為40 mg/kg，2 h后測定各組小鼠的痛閾值，然后立即處死小鼠，按2.2.2項下操作，測其腦組織藥物含有量。

2.7.2 外周抗炎鎮(zhèn)痛藥效的研究 對藥物外周抗炎止痛藥效研究常采取乙酸扭體法［5］。結(jié)果見表5。

靜脈注射組:操作如下:取32只體質(zhì)量20 g左右雌雄兼用的小鼠，隨機分為4組，每組8只，分別尾靜脈注射生理鹽水、空白固體脂質(zhì)納米粒、鹽酸青藤堿溶液、鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，給藥劑量為10 mg/kg。15 min后分別給各組小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，記錄注射醋酸后20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。并從各組小鼠眼眶靜脈叢取血0.1 mL，按2.2.1項下操作，測其血藥濃度。

經(jīng)皮給藥組取32只小鼠，隨機分為4組，每組8只，脫去背部2.0 cm×2.0 cm毛，分別涂抹生理鹽水、空白固體脂質(zhì)納米粒、鹽酸青藤堿溶液、鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒，給藥劑量為40 mg/kg，2 h后腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，記錄20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。并從各組小鼠眼眶靜脈叢取血0.1 mL，按2.2.1項下操作，測其血藥濃度。

表5 藥效實驗(n=4，±s)Tab.5 Pharmacodynam ics of sinomenine hydrochloride(n=4，±s)

表5 藥效實驗(n=4，±s)Tab.5 Pharmacodynam ics of sinomenine hydrochloride(n=4，±s)

注:與生理鹽水組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組別靜脈注射20 min后 經(jīng)皮2 h后腦組織含藥量/(μg·mL －1)血漿含藥量/(μg·mL －1)腦組織含藥量/(μg·mL －1)血漿含藥量/(μg·mL －1)生理鹽水 0 0 0 0空白-固體脂質(zhì)納米粒 0 0 0 0含藥水溶液 2.71±0.02 8.1±0.05 1.56±0.07 6.5±0.05含藥-固體脂質(zhì)納米粒 4.82±0.06＊＊ 11.6±0.04* 3.3±0.04* 13.3±0.02＊＊

表4及表5即靜脈注射和經(jīng)皮兩種不同給藥方式分別對其中樞鎮(zhèn)痛和外周抗炎鎮(zhèn)痛藥效實驗的結(jié)果。鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒較鹽酸青藤堿溶液，在兩種不同給藥方式下，對小鼠痛閾提高率都有很大程度增加，尾靜脈注射鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒30 min后其痛閾值的提升率顯著高于經(jīng)皮給藥鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒。

醋酸扭體實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠腹部注射0.6%醋酸溶液后，各組動物均出現(xiàn)明顯的扭體反應(yīng)，其中給藥組動物的扭體反應(yīng)明顯減輕。在相同劑量的情況下，相比而言鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)皮給藥途徑組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù) (18.2±6.7)明顯少于靜脈注射途徑組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù) (23.7±4.9)，說明經(jīng)皮給藥對外周鎮(zhèn)痛具有顯著的抑制率。

3 討論

鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的各項評價指標均顯示該制劑質(zhì)量良好，工藝簡單;比較鹽酸青藤堿水溶液和鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的體外釋藥結(jié)果可以看出，鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒比鹽酸青藤堿水溶液具有明顯的緩釋作用，在最初的一段時間內(nèi)藥物釋放的速率比較快，但在之后的考察時間內(nèi)則表現(xiàn)出明顯的緩釋作用，這是由于突釋階段的藥物主要來自吸附在納米粒表面以及包埋在載體淺表的藥物分子，同時納米粒巨大的比表面積及其表面結(jié)合的表面活性劑分子也有利于藥物的溶出，導致藥物在漏槽條件下的快速釋放［18-19］，或者是因為鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒的粒徑在200 nm以下能夠透過220μm的濾膜［20］。

體內(nèi)研究證實，鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒不論是在靜脈注射還是經(jīng)皮給藥均有很好的緩釋效果，這與前一部分的體外釋藥結(jié)果是一致的。因此在鎮(zhèn)痛和醋酸扭體實驗中發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒因其緩釋作用可以顯著的延長其作用時間。靜脈注射鎮(zhèn)痛藥效研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒能使腦組織中藥物的量有一定的增加，中樞鎮(zhèn)痛作用有所加強。這可能是鹽酸青藤堿固體脂質(zhì)納米粒中的聚山梨酯-80可以增加固體脂質(zhì)納米粒與腦組織細胞融合，使藥物透過血腦屏障，增加藥物中樞鎮(zhèn)痛作用的效果。

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