周榮平， 陳 剛， 沈志力， 潘立群

(1．南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京210046;2．南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院，江蘇 南京211100)

MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中，19～24核苷酸長度的內源性單鏈非編碼小RNA分子，其與靶基因mRNA通過堿基配對方式引導 RNA沉默復合體 (RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯 ，在轉錄后水平負調節(jié)基因的表達，從而參與了細胞的一系列重要進程，包括細胞增殖［1］、凋亡［2］、發(fā)育［3］、分化［4］和代謝［5］等。它的表達在許多腫瘤中發(fā)生異常改變，所以miRNA與癌癥的研究，對于認識癌癥的發(fā)生、診斷、治療有了新的啟示。

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康。目前，化療是胃癌綜合治療的重要組成部分，5-氟尿嘧啶、鉑類仍是首選化療藥物，含新型化療藥物在內的聯(lián)合化療方案鮮見更優(yōu)越的有效性和安全性。華蟾素 (cinobufacin)是中藥復方制劑，具有清熱解毒、利水消腫、化瘀潰堅等作用。很多研究表明華蟾素通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡等機制發(fā)揮抗腫瘤作用，對肝癌、食管癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病等多種腫瘤細胞產生抑制作用［6-8］。但是，目前關于miRNA與華蟾素抗胃癌作用之間關系的研究還甚少。本實驗研究華蟾素對人胃癌BGC-823細胞株的抑制增殖、誘導凋亡作用以及miRNA表達譜的變化，以探討miRNA參與調控華蟾素抗胃癌作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823細胞 (東南大學醫(yī)學院表遺傳實驗室提供);華蟾素注射液 (2 mg/mL，5 mL/支，安徽金蟾生化股份有限公司);DMSO(SIGMA);鏈霉素混合液 (Keygen);胰蛋白酶-EDTA消化液 (Keygen);MTT試劑盒 (BIOSHARP);Trizol(Invitrogen， Carlsbad， CA，USA);基因芯片及相關試劑盒 (上?？党缮锕?;RNA純化試劑盒 (Takra);實時定量PCR試劑盒 (Takra)。

1.2 常規(guī)細胞培養(yǎng) 人胃癌BGC-823細胞在含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃，5%二氧化碳的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測華蟾素對細胞增殖的抑制作用細胞消化、計數(shù)、配制成密度為3×104個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細胞懸液 (每孔3×103個細胞)，96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需質量濃度 (50、25、12.5 mg/mL)，每孔加入200μL相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組，陽性對照組;96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h;每孔加入20μL MTT(5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO溶解，酶標儀讀出每孔的OD值，計算抑制率及細胞生存率。

細胞生存率 (%)=100%－實驗組抑制率(%)

應用SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0通過機率單位加權回歸法 (Bliss法)計算IC50

1.4 MiRNA芯片分析 華蟾素處理對數(shù)生長期人胃癌BGC-823細胞48 h后，用 Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取總 RNA，總 RNA在3'-端用miRCURYTM LNA Arrays進行雜交，通過GenePix 4000B掃描儀和Gene Pix 6.0軟件進行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析圖像存成TIF文件，使用GenePixPro 6.0分析數(shù)據(jù) (本實驗由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?。

1.5 miRNA生物信息學分析 華蟾素作用于人胃癌BGC-823細胞為48 h后，獲得表達上調或下調的miRNA表達譜。應用miRWalk數(shù)據(jù)庫分析預測差異表達miRNA的靶基因。

1.6 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應 (RTPCR)實驗 將microRNA芯片結果中差異表達較顯著的2個miRNA進一步進行RT-PCR檢測。

人胃癌BGC-823細胞用50 g/mL華蟾素處理48 h后使用 TRIzol法提取細胞總 RNA，NanoDrop ND—1000全波長紫外測量光密度 D(260/280)，1%的瓊脂糖電泳鑒定并進行反轉錄 U6作為內參照RT-PCR引物序列如表1。將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系。體系配置如下:2×Master Mix 5μL，10μmol/L的PCR特異引物F，0.5μL 10μmol/L的PCR特異引物R 0.5μL。加水至總體積為8μL，5 000 r/min短暫離心，將8 μL混合液加到384-PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2μL cDNA。將上述PCR板置于Realtime PCR儀上進行PCR反應。所有的指標均按以下程序進行:95℃，10 min;40個PCR循環(huán) (95℃，10 s;60℃，60 s(收集熒光)。按 (95℃，10 s;60℃，60 s;95℃，15 s);并從60℃緩慢加熱到99℃ (儀器自動進行-Ramp Rate為2%)。各樣品的目的miRNA和內參 (U6)分別進行Realtime PCR反應。數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT法進行分析 (本實驗由上海康成生物工程有限公司完成)。

表1 m iR-29a、m iR-26a引物序列Tab.1 Primer sequence of m iR-29a and m iR-26a

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0軟件行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，計量資料數(shù)據(jù)兩組間均數(shù)比較采用成組t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同質量濃度華蟾素對人胃癌細胞BGC-823生長的抑制作用 見圖1。不同質量濃度華蟾素處理人胃癌細胞BGC-823 24、48、72 h后，細胞的生長均受到不同程度的抑制。華蟾素50 mg/mL作用48 h對人胃癌BGC-823細胞的生存率為39.72%，均高于其他質量濃度劑量組及時間點，隨著藥物質量濃度的增加，華蟾素對人胃癌BGC-823細胞的生長抑制作用明顯增強 (見圖1)，具有劑量相關性，各質量濃度組與對照組相比，不同質量濃度的華蟾素對細胞增殖抑制率具有顯著性(P ＜0.05)。

圖1 MTT法檢測華蟾素對胃癌細胞增殖的抑制作用折線圖Fig.1 Cinobufacin inhibited p roliferation of BGC823 cells measured by MTT assay

2.2 華蟾素對人胃癌BGC-823細胞miRNA表達的影響及其靶基因的預測 華蟾素處理48h后，使人胃癌細胞BGC-823的miRNA中33個miRNA表達上調1.5倍以上，分別為hsa-miR-18a-5p、hsamiR-29a-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-29a-3p、hsamiR-424-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-27a-3p、hsamiR-29b-3p、 hsa-miR-21-5p、 hsa-miR-5684、 hsamiR-20b-5p、hsa-miR-4521、hsa-miR-335-5p、hsamiR-4321、 hsa-miR-299-3p、 hsa-miR-107、 hsamiR-30d-5p、 hsa-miR-4288、 hsa-miR-138-2-3p、hsa-miR-19a-3p、 hsa-miR-494、 hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-15a-5p、 hsa-miR-29a-3p、 hsa-miR-3177-3p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-493-5p、hsa-miR-4500、hsa-miR-1273g-3p，12 個miRNA表達下調1.5倍以上，分別為hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-33b-5p、hsa-miR-548as-3p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-1246。

2.3 qRT-PCR的方法驗證華蟾素誘導的miRNA的表達 選取芯片中表達上調的miRNA分子中的兩個miRNA，即miR-29a和miR-26a，利用實時定量RT-PCR的方法進行驗證。結果如圖2，華蟾素可以誘導miR-29a和miR-26a的表達上調，與基因芯片結果相一致。

圖2 華蟾素誘導人胃癌BGC-823細胞m iR-29a和m iR-26a表達上調的qRT-PCR驗證結果Fig.2 Upregulated expression of m iR-29a and m iR-26a in BGC-823 cells treated with Cinobufacin confirmed by qRT-PCR

2.4 生物信息學方法預測miR-29a和miR-26a的靶基因 利用生物信息學方法，miRWalk數(shù)據(jù)庫分析預測差異表達miR-29a和miR-26a的靶基因，見表2。

表2 m iR-29a和m iR-26a的靶基因Tab.2 Target genes of m iR-29a and m iR-26a

3 討論

華蟾素具有抑制腫瘤細胞核酸代謝，干擾DNA和RNA的合成，阻礙細胞有絲分裂，從而使腫瘤細胞形態(tài)和功能發(fā)生變化，破壞細胞結構，促使細胞凋亡等藥理作用［9-11］。本研究結果顯示:在本研究中，華蟾素抑制了胃癌BGC-823細胞系的生長，并具有時間依賴性。這與Han等［12］的研究結果相一致。由此可見，華蟾素對人胃癌BGC-823細胞有明顯增殖抑制作用，且在一定范圍內，隨華蟾素質量濃度增加作用時間延長，細胞增殖抑制率相應增加，具有時效和量效關系。

許多研究顯示華蟾素通過免疫調節(jié)抑制腫瘤生長、誘導腫瘤細胞分化、影響細胞周期、抑制腫瘤血管形成、調節(jié)酶活性以及抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡等機制達到抗腫瘤作用，但有關miRNA參與華蟾素抗癌機制的研究未見報道。miRNA可通過負調控靶基因 (癌基因或抑癌基因)的表達，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，所以miRNA的調控機制在中醫(yī)藥抗胃癌中的研究正成為當今研究的熱點。有研究顯示，白藜蘆醇、延胡索總堿、姜黃素等多種中藥抗腫瘤作用與miRNA表達變化相關［13-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素抑制胃癌 BGC-823細胞株增殖過程中，伴隨著miRNA表達譜的改變，在所有571個miRNA分子中表達上調的有33個，表達下調的有12個，在表達上調的miRNA分子中，選取 miR-29a、miR-26a進行實時定量 qRTPCR方法進行驗證，結果顯示其表達倍數(shù)與芯片結果相一致。

有研究顯示miR-29a通常表現(xiàn)為抑癌基因的作用，它的過表達可以降低包括肺癌、鼻咽癌、膽管癌等多種實體腫瘤細胞的增值和侵襲潛能［16-18］，除此之外，研究顯示，miR-26a在肝細胞性肝癌中表達顯著下調［19］。許多證據(jù)提示，miRNA與腫瘤相關的信號轉導通路具有密切的聯(lián)系［20］。通過生物信息學方法 (miRWalk)進行miRNA的靶基因預測，其中miR-29a的靶基因中，有與抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡相關的基因，如PPM1D、Wip-1、bcl-2、MCL-1、Caspse-8、P53 等，Meng 等［21］利用Western-blot和實時定量RT-PCR技術檢測肝癌組織中miR-29呈低表達，進一步證實P53信號通路中的PPMID、Wip-1是 miR-29a的直接靶點。miR-26a的可能靶基因中有與細胞周期通路相關因子如PCNA、CDK1、PEBP1等，miR-26a可能調控這些靶基因的表達來抑制腫瘤細胞的增殖。劉友平等［22］利用 miR-26a mimics轉染人肝癌細胞株HepG2方法，證實miR-26a可能通過調控細胞增殖通路相關蛋白的表達，參與肝癌細胞周期的調控以抑制肝癌細胞的增殖，從而達到抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。通常一個基因可以被多個miRNA所調節(jié)，同時一個miRNA也可以調節(jié)多個miRNA，所以，推測華蟾素可能通過誘導某些重要的miRNA分子如miR-29a、miR-26a等的過表達，由這些分子共同來調控增殖通路中的相關基因，抑制胃癌細胞株增殖。但是，關于華蟾素誘導某些特定miRNA表達變化的可能機制、驗證與抗胃癌作用相關的特定miRNA的功能及其對應的靶基因之間的關系，還有待進一步更深入的研究。

綜上所述，華蟾素抑制胃癌BGC-823細胞株增殖作用可能與miRNA表達譜的變化密切相關。本研究可能為miRNA調控華蟾素抗胃癌的機制提供了新的理論依據(jù)，同時也為華蟾素治療胃癌找到一個新的敏感性指標。

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