袁慕云 卓錦雪 許龍巖 陳碧玲 張 旺

（廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623）

1 前言

金黃色葡萄球菌在食品污染病例中占據(jù)十分重要的位置，同時也是醫(yī)院臨床感染導致肺炎及傷口感染的主要病原菌。隨著抗生素的廣泛應用，金黃色葡萄球菌對目前使用的各種抗生素呈現(xiàn)出越來越普遍的耐藥性，并表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床治療帶來了很大困難[1-4]。本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌的nor A基因序列分別設(shè)計擴增引物和測序引物，用PCR-焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌，用Vitek2進行藥敏試驗，分析金黃色葡萄球菌耐藥情況。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株信息

金黃色葡萄球菌共28株：MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)臨床分離株9株，菌株編號為JPA-JPI；不同食品中分離株MSSA(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌) 19株，菌株編號為JP1-JP19，菌株信息按文獻5。

陰性對照菌株8株：分別為單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC2921、大腸桿菌ATCC25922。

上述菌株來自中國藥品生物制品鑒定所、華南理工大學食品學院和廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，且均經(jīng)過VITEK 2和API試劑條確證。

2.1.2 主要儀器

焦磷酸測序PyroMark lD系統(tǒng)：瑞典Biotage公司；PCR擴增儀：PE 9700型；核酸提取儀：日本PSS公司。

2.1.3 試劑

PCR用Buffer、d NTP、瓊脂糖、PCR分子量標記(50-500 bp)、Taq酶：大連寶生物工程有限公司；焦磷酸測序用試劑：QIAGEN上海辦事處；7.5 %氯化鈉肉湯：北京陸橋有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)G e n B a n k公布的金黃色葡萄球菌n o r A基因( Gen B an k:D 9 0 11 9.1 )中保守區(qū)域，用Py r o M ar k A ssay D esig n 2.0軟件設(shè)計引物和測序引物，上游引物5’-CGAGAGTGATTGGTGGTATGAGTG-3’，下游引物5’-CGCTGACATGTAGCCAAAGTTTT-3’，測序引物5’-TGGTGTGACAGGTTTAATAG-3’，下游引物5’端標記生物素，擴增片段大小113bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.2.2 模板制備、PCR擴增體系、電泳參數(shù)、單鏈模板制備及焦磷酸測序

模板制備、PCR擴增體系、電泳參數(shù) 、單鏈模板制備及焦磷酸測序，按文獻6進行。

2.2.3 焦磷酸測序結(jié)果判斷

從NCBI網(wǎng)站的BLAST功能反復比對分析發(fā)現(xiàn)，利用nor A基因測序引物后的30個連續(xù)DNA堿基序列5’-CTGACATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA-3’，可達到鑒定金黃色葡萄球菌的目的，因此本研究判斷結(jié)果的依據(jù)為：測序的30個DNA堿基序列與上述序列100%匹配，則判斷為金黃色葡萄球菌。

2.2.4 藥敏試驗

參照文獻5和文獻7，用AST-GP67藥敏卡，在Vitek 2上對28株金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗。質(zhì)控菌株為為MRSA ATCC29213、MRSS ATCC25923。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴增結(jié)果

28株金黃色葡萄球菌均擴增出113bp大小的nor A基因DNA片段（圖1，本研究只列出20株金黃色葡萄球菌電泳圖），而單增李斯特氏菌等對照菌株未見擴增條帶（圖略）。

圖1 金黃色葡萄球菌nor A基因PCR擴增電泳圖

3.2 焦磷酸測序結(jié)果

根據(jù)模板濃度等條件的不同，28株金黃色葡萄球菌分別測出37bp-42bp長短不等的DNA堿基序列（表1），圖2、圖3為JPA、JP5焦磷酸測序結(jié)果圖，而單增李斯特菌等8株對照株未測出DNA堿基序列。測序結(jié)果分別與測序引物后的DNA序列比對，發(fā)現(xiàn)100%匹配的DNA堿基數(shù)為34bp-40bp，所有有效測序結(jié)果均超過30個堿基（表1），表明測序引物的特異性較好，擴增體系優(yōu)化較佳，并且可用CTGACATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA 堿基序列特異性地檢測金黃色葡萄球菌。

表1 金黃色葡萄球菌焦磷酸測序檢測結(jié)果

圖2 JPA焦磷酸測序結(jié)果圖

圖3 JP5焦磷酸測序結(jié)果圖

表1顯示，JPA、JP3、JP5、JP6、JP7、JP1 7等6株菌株第5個堿基均為T，在N CB I網(wǎng)站查找金黃色葡萄球菌n o r A基因序列(GenBank:D90119.1)， 發(fā)現(xiàn)該位點的堿基為C，表明試驗菌株在該位點發(fā)生了C-T突變。查找nor A基因編碼的蛋白氨基酸序列，共389個氨基酸，突變位點是nor A基因第354個堿基、118個氨基酸-天冬氨酸位點，該位點發(fā)生C-T的突變后，密碼子GAC變成GAU，而兩個密碼子都是天冬氨酸的密碼子，表明該基因表達的nor A蛋白氨基酸序列無變化；JP3、JP5、JP17等3株菌的第28個堿基均為T，同樣在NCBI網(wǎng)站查找nor A基因序列， 該位點的堿基為C，表明試驗菌株在該位點發(fā)生了C-T突變，突變位點是nor A基因的第377個堿基、126個氨基酸-丙氨酸位點，該位點發(fā)生C-T的突變后，密碼子GCA變成 GUA，查密碼子表，GCA是丙氨酸氨的密碼子，GUA是纈氨酸密碼子，表明nor A基因編碼的蛋白氨基酸序列發(fā)生了改變。

3.3 耐藥試驗結(jié)果

28株金黃色葡萄球菌有14種耐藥譜，其中NA 1：4株；NA 2：6株；NA 11、NA 13：各3株；NA9 、NA14：各2株；NA3、NA4、NA5、NA 6、NA7、NA8、NA 10、NA 12：各1株。具體見表2。

28株菌株對亞胺培南、萬古霉素、替考拉寧、利福平等8種抗生素均敏感；對青霉素的耐藥率最高，共有20株，占71.4%；其次為紅霉素、苯唑西林和四環(huán)素，分別占35.7%、32.1%和28.6%。對青霉素耐藥的20株菌株中，MRSA 9株，MSSA 11株；對苯唑西林耐藥的9株菌株均為MRSA。具體見表2、表3。

表2 8株金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

表3 28株金黃色葡萄球菌耐藥率

4 討論

目前金黃色葡萄球菌的耐藥性日益惡化，特別是其對氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)超強耐藥。隨著細菌耐藥性研究的深入，外輸泵nor A基因介導的氟喹諾酮耐藥性逐漸引起人們的重視，不同菌株中該主動外排介導的耐藥性表現(xiàn)程度成為人們考查的重點[8-11]。大量研究表明，nor A基因介導的金黃色葡萄球菌對FQNS耐藥相當普遍[12-13]，因為nor A基因是金黃色葡萄球菌的結(jié)構(gòu)基因，其編碼的nor A蛋白能將親水性氟喹諾酮類藥物自菌體內(nèi)主動泵出，使藥物在菌體內(nèi)蓄積減少。

本研究根據(jù)nor A基因序列分別設(shè)計擴增引物和測序引物，用PCR-焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌，用Vitek2進行藥敏試驗，分析金黃色葡萄球菌耐藥情況。28株金黃色葡萄球菌均擴增出大小113bp大小的DNA片段，焦磷酸測序結(jié)果與nor A基因測序引物后的堿基序列比對，100%匹配的堿基數(shù)均超過30個DNA堿基序列，而其他如單增李斯特氏菌等對照菌株P(guān)CR擴增結(jié)果和焦磷酸測序結(jié)果均陰性，表明用nor A為目的基因，可特異性檢測金黃色葡萄球菌。

耐藥試驗結(jié)果顯示，28株金黃色葡萄球菌有14種耐藥譜，其中9株MRSA有4種耐藥譜，19株MSSA有10種耐藥譜。MRSA耐藥譜中，NA11耐藥譜的3株菌株對兩種抗生素耐藥，其他3種耐藥譜的6株菌株均是多重耐藥菌。MSSA耐藥譜中，NA5 耐藥譜的JP11對5種抗生素耐藥，JP11是鰻魚中分離的菌株，表明在鰻魚養(yǎng)殖過程中使用了較多的抗生素，出現(xiàn)多重耐藥菌。分析nor A基因突變對喹諾同類抗生素的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)對喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星耐藥的菌株為NA 5耐藥譜中的JP11和NA12耐藥譜中的JPB，而發(fā)生突變的6株菌株JPA、JP3、JP5、JP6、JP7、JP17分布在NA1、NA2和NA11 等3種不同的耐藥譜中，均對喹諾酮類抗生素敏感。表明，nor A基因第354和377堿基位點的突變與喹諾酮類抗生素耐藥性無關(guān)。

5 結(jié)論

n or A基因可作為金黃色葡萄球菌分子鑒別的的參考基因，并且可用CTGA CATTTC ACCAAGCCAT CAAAAAGCA 堿基序列特異性地檢測金黃色葡萄球菌；nor A基因第354和377堿基位點的突變與喹諾酮類抗生素耐藥性無關(guān)。

［1］ 楊自華，劉秋芹，吳勁松，等.某院2012年金黃色葡萄球菌感染分布及其耐藥性分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34(13):1698-1702.

［2］ 王登峰，李建軍，段新華，等.我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏檢測方法探討[J].中國動物傳染病學報，2011，19(1):31-38.

［3］ 姜延龍，張宇，田波，等.PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌進展[J].食品科學，2006，27(5): 265-269.

［4］ 王登峰，李建軍，段新華，等.我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏檢測方法探討[J].中國動物傳染病學報，2011，19(1):31-38.

［5］ 許龍巖，袁慕云，唐勤，等.PCR-焦磷酸測序檢測金黃色葡萄球菌研究[J].檢驗檢疫學刊，2013，23(1):29-33.

［6］ 許龍巖，袁慕云，唐勤，等.PCR-焦磷酸測序檢測單核細胞增生李斯特氏菌研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2013，25(3):201-205.

［7］ 張曉恒，夏云，曹何，等.Vitek-2 藥敏卡片檢測MRSA的準確性評價[J].重慶醫(yī)科大學學報，2010，35(9):1384-1385.

［8］ 鐘利，黃永茂，唐凌.氟喹諾酮類藥物對金黃色葡萄球菌nor A基因表達的影響研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2008，18(6):751-753.

［9］ 王衛(wèi)華，陳潔，汪麗，等.醫(yī)院與社區(qū)獲得性感染金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因初步研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2006，16(8):865-867.

［10］ 周麗娟.171 株金黃色葡萄球菌的分布與耐藥性分析[J].抗感染藥學，2013，10(2):128-131.

［11］ 朱以軍.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥機制及檢測[J].國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2005，26(1):26-28.

［12］ 宋戰(zhàn)昀，馮新，韓文瑜，等.金黃色葡萄球菌nor A 外輸泵中藥耐藥抑制劑的篩選[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2007，29(3):329-333.

［13］ 陳寒冬，鐘利，閆宏，等.鈞介導對氟喹諾酮類藥物耐藥的金黃色葡萄球菌nor A基因的研究[J].中國抗生素雜志，2012，37(11): 851-855.