王文肖淳李海濤唐兆華師藝峰謝延風(fēng)石全紅

外傷性癲癇（post－traumatic epilepsy，PTE）是繼發(fā)于顱腦損傷后的發(fā)作性功能異常，在開放性顱腦損傷中發(fā)生率可達(dá)50%甚至更高比例[1]。PTE嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制和防治一直是神經(jīng)外科醫(yī)師研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。已有大量研究表明鈣通道參與癲癇形成[2－4]，鈣通道異常引起Ca2＋過度內(nèi)流，大量神經(jīng)元同步過度放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。鈣釋放激活的鈣(calcium release－activated calcium，CRAC)通道是鈣通道中的一種位于細(xì)胞質(zhì)膜上的慢鈣通道?；|(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1(calcium release－activated calcium channel modulator 1,ORAI1/CRACM1)是CRAC通道的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，介導(dǎo)CRAC通道的組成和激活。本實(shí)驗(yàn)通過建立PTE大鼠模型，研究STIM1和ORAI1在PTE大鼠腦組織中的表達(dá)變化，以期闡明CRAC通道與PTE的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠84只，體質(zhì)量200～250g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組42只和實(shí)驗(yàn)組42只。試劑：100 mmol/L FeCl3溶液(美國(guó)Sigma公司)，STIM1兔單克隆抗體IgG（美國(guó)Abcam公司），ORAI1兔多克隆抗體IgG(美國(guó)Proteintech Group公司)，β－肌動(dòng)蛋白（actin）鼠多克隆抗體IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（中國(guó)北京中杉金橋公司），PCR引物由北京六合華大基因科技公司合成，Trizol RNA抽提試劑、SYBR Green PCR Master Mix及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 PTE模型的制作 大鼠經(jīng)3.5%水合氯醛溶液(10mL/kg)腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，手術(shù)暴露顱骨。參照Golden N等[5]實(shí)驗(yàn)方法，在左側(cè)冠狀縫后1mm、矢狀縫旁2mm處鉆開顱骨。用微量注射器將5μL濃度為100mmoL/L FeCl3溶液在5min內(nèi)勻速注射到大鼠皮層內(nèi)，進(jìn)針深度3mm，注射完后，留滯針頭5min以防外溢。對(duì)照組注射等量生理鹽水。2h后(麻醉完全蘇醒)觀察行為學(xué)表現(xiàn)，參照改良Racine法(無(wú)任何癲癇發(fā)作行為記0分;凝視發(fā)作記1分;規(guī)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng)，伴或不伴面部抽動(dòng)記2分;單側(cè)前肢抖動(dòng)記3分;站立、雙前肢抖動(dòng)及持續(xù)性點(diǎn)頭記4分;雙側(cè)肢體顫動(dòng)加重，失去平衡跌倒而全身性強(qiáng)直陣攣性發(fā)作記5分;發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡記6分)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作進(jìn)行評(píng)分，癲癇發(fā)作判定:將≥3分的行為學(xué)改變定義為癲癇發(fā)作，視為制模成功，對(duì)造模不成功或死亡的動(dòng)物剔出實(shí)驗(yàn)，并通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模。按不同時(shí)間點(diǎn)（傷后6h、24h、72h、7d、14d、21d、28d）隨機(jī)選取6只大鼠，腹腔麻醉后斷頭取腦組織。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)STIM1和ORAI1 mRNA表達(dá) STIM1上游引物5'－CTGGTGGAGAAACTGCCTGAC－3'，下 游 引 物 5'－GGCTAAGAGAATGGGAAGAATCC－3'；ORAI1 上游 引 物5'－ AGGGTTGCTCATCGTCTTTAGTG －3'，下 游 引物 5'－ CTCGTGGGGTGACTCTTTGAC －3'；β－actin上 游 引物 5'－ ACGGTCAGGTCATCACTATCG －3'，下游引物5'－ GGCATAGAGGTCTTTACGGATG －3'。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品濃度（A值）及純度（A260/A280值在1.7～2.0范圍內(nèi)）并進(jìn)行標(biāo)化。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃15min，85℃ 5s，保存于－20℃。以cDNA為模板，β－actin為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25μL。PCR結(jié)果采用Ct值比較相對(duì)定量法，β－actin為內(nèi)參照。

1.4 Western blot檢測(cè)STIM1和ORAI1蛋白表達(dá)按說明書提取總蛋白質(zhì)，并用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)化。以β－actin為內(nèi)參蛋白。蛋白樣品加入變性緩沖液于沸水中煮5min，10000 r/min離心5min后上樣。十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜；分別加入抗STIM1抗體(1∶2000)、抗ORAI1抗體（1:800）、抗β－actin抗體（1∶3000）置于4℃孵育過夜；加入二抗（1∶3750）于37℃孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。

1.5 免疫組化檢測(cè)STIM1和ORAI1蛋白表達(dá)取出石蠟塊，行連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，按照說明書采用SP法進(jìn)行染色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。STIM1一抗?jié)舛葹?：100，ORAI1一抗?jié)舛葹?:800。采用Image－Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行掃描，半定量分析STIM1和ORAI1在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組皮層中的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（用LSD－t檢驗(yàn)比較兩兩之間的差異），兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。檢測(cè)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 對(duì)照組未觀察到癲癇發(fā)作。實(shí)驗(yàn)組共給50只大鼠注射FeCl3，其中42只出現(xiàn)典型癲癇發(fā)作，制模成功率為84.0%。傷后6h內(nèi)出現(xiàn)程度不一的癲癇發(fā)作，如凝視、不動(dòng)，重復(fù)、刻板地點(diǎn)頭、咀嚼，濕狗樣抖動(dòng)，伴或不伴面部抽動(dòng)，單側(cè)前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭，雙前肢顫動(dòng)加重失去平衡跌倒，全身性強(qiáng)直－陣攣發(fā)作，未見發(fā)作嚴(yán)重而死亡的大鼠。平均約30 min發(fā)作1次，每次持續(xù)1～3 min，局灶性發(fā)作多見，發(fā)作間期進(jìn)食、活動(dòng)減少。3d內(nèi)癲癇發(fā)作仍較頻繁，平均每小時(shí)發(fā)作1次，持續(xù)時(shí)間約1～2min。7d后發(fā)作次數(shù)有所減少，但每日均有2～4次的規(guī)律發(fā)作。28d癲癇發(fā)作顯著減少，其中4只可見1次發(fā)作，另2只未見發(fā)作。

2.2 RT-PCR結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組傷后STIM1、ORAI1各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增高（F值分別為 120.829、45.882，P均＜0.05），72h 組表達(dá)為最高峰（P均＜0.05）。見表1。

2.3 Western blot結(jié)果 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)STIM1、ORAI1比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為27.615、65.093，P均＜0.05）。兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組傷后6h STIM1的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.322），此后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增高（傷后24h、72h、7d、14d、21d、28d的P均＜0.01），72h組表達(dá)為最高峰（P均＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組傷后6h ORAI1表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化（P值為0.054），此后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增高（傷后24h、72h、7d、14d、21d、28d的P均＜0.01），72h組表達(dá)為最高峰（P均＜0.01）。見表1、圖1～3。

2.4 免疫組化結(jié)果 在STIM1和ORAI1傷后表達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)（72h），取傷灶周邊皮層做免疫組織化學(xué)法，進(jìn)一步測(cè)定其蛋白的表達(dá)水平。STIM1在對(duì)照組皮層神經(jīng)元中僅有弱陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組STIM1在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯增加（t＝16.233，P＜0.05）。ORAI1在對(duì)照組皮層神經(jīng)元僅有弱陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組ORAI1在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯增加（t＝17.339，P＜0.05）。見圖4、表2。

表1 大鼠皮層STIM1、ORAI1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

表2 PTE大鼠皮層STIM1、ORAI1陽(yáng)性表達(dá)（AOD值）水平

3 討論

目前研究認(rèn)為顱腦外傷后出血分解產(chǎn)生的鐵離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷是PTE的啟動(dòng)因素[6]，因此常用皮層注射鐵離子致動(dòng)物癲癇發(fā)作，制作PTE模型，研究PTE發(fā)作的機(jī)制[7,8]。本實(shí)驗(yàn)組共給50只大鼠注射FeCl3，制模42只，成功率達(dá)84.0%，傷后28d，均有癲癇發(fā)作，成功制作FeCl3外傷性癲癇模型。說明FeCl3誘導(dǎo)的大鼠癇性發(fā)作成功率高、穩(wěn)定性好，是一種理想的PTE動(dòng)物模型。

CRAC通道是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的慢鈣通道，對(duì)鈣離子具有高度選擇性，鈣庫(kù)中鈣濃度明顯下降或清空時(shí)被激活。STIM1和ORAI1與CRAC通道的組成和激活密切相關(guān)。STIM1主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其主要作用是感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)中鈣濃度的多少，并將這一信號(hào)傳遞至細(xì)胞膜上的CRAC通道，直接調(diào)控通道的開啟和關(guān)閉[9]。ORAI1位于細(xì)胞膜上，目前認(rèn)為是構(gòu)成CRAC通道的主要成分。大量研究顯示在自身免疫病、免疫缺陷病、支氣管哮喘等諸多人類疾病中，CRAC通道活性異常。近年研究認(rèn)為動(dòng)物神經(jīng)元也存在CRAC通道[10,11]，特別是椎體神經(jīng)元的胞體和樹突、小腦的浦肯野和顆粒神經(jīng)元。

圖1 大鼠皮層STIM1、ORAI1蛋白的表達(dá)，*：與對(duì)照組比較，P＜0.05

圖2 Western blot顯示大鼠皮層STIM1蛋白的表達(dá)，1：對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)組6h；3：實(shí)驗(yàn)組24h；4：實(shí)驗(yàn)組72h；5：實(shí)驗(yàn)組7d；6：實(shí)驗(yàn)組14d；7：實(shí)驗(yàn)組21d；8：實(shí)驗(yàn)組28d

圖3 Western blot顯示大鼠皮層ORAI1蛋白的表達(dá)，1：對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)組6h；3：實(shí)驗(yàn)組24h；4：實(shí)驗(yàn)組72h；5：實(shí)驗(yàn)組7d；6：實(shí)驗(yàn)組14d；7：實(shí)驗(yàn)組21d；8：實(shí)驗(yàn)組28d

圖4 免疫組化檢測(cè)傷后72h大鼠皮層STIM1、ORAI1的表達(dá)情況。A:STIM1對(duì)照組（400×），B:STIM1實(shí)驗(yàn)組（400×）C:ORAI1對(duì)照組（400×），D:ORAI1實(shí)驗(yàn)組（400×）

本組研究通過對(duì)大鼠行為學(xué)的觀察，發(fā)現(xiàn)鐵離子致傷后大鼠癲癇發(fā)作明顯增加。同時(shí)，RT－PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PTE大鼠傷后不同時(shí)間點(diǎn)STIM1、ORAI1的mRNA表達(dá)均顯著升高，Western blot檢測(cè)顯示STIM1、ORAI1蛋白在傷后也明顯增加，免疫組化同樣證實(shí)了STIM1、ORAI1蛋白在傷后的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果充分說明CRAC通道異常與外傷性癲癇密切相關(guān)。目前研究認(rèn)為，細(xì)胞受刺激后可激活細(xì)胞膜磷脂酶C(phospholipase C，PLC)，作用于4,5－二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol－4,5－bisphosphate，PIP2)使其分解為三磷酸肌醇（inositol 1，4，5－triphosphate，IP3）和甘油二脂。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度輕微升高，由此進(jìn)一步引起更多IP3受體通道的開放，大量Ca2＋從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度的降低激活STIM1；與此同時(shí)，質(zhì)膜上的ORAI1蛋白自發(fā)的組裝成四聚體CRAC通道[12]。我們推測(cè)，鐵離子致傷后導(dǎo)致神經(jīng)元過氧化反應(yīng)，可能通過上述途徑大量激活STIM1和ORAI1，從而使CRAC通道開放增多，導(dǎo)致Ca2＋大量?jī)?nèi)流。Ca2＋大量?jī)?nèi)流引起神經(jīng)元持續(xù)去極化，形成同步性爆發(fā)性放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)生[13]。

本組研究還發(fā)現(xiàn)在傷后28d，實(shí)驗(yàn)組仍有癲癇發(fā)作，且STIM1、ORAI1的表達(dá)仍顯著高于對(duì)照組。Steinbeck JA等也發(fā)現(xiàn)在鼠類慢性癲癇模型以及人類顳葉癲癇腦標(biāo)本中，STIMI的表達(dá)明顯增高[14]。提示CRAC通道異常還可能參與晚期癲癇的形成。這可能與胞內(nèi)鈣超載致神經(jīng)元凋亡，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，膠質(zhì)瘢痕形成，引起神經(jīng)元膜電位平衡性和穩(wěn)定性紊亂有關(guān)[15]。此外，Gasperini R等研究發(fā)現(xiàn)CRAC通道與突觸可塑性有關(guān)[16]，PTE大鼠皮層STIM1和ORAI1表達(dá)上調(diào)，也可能通過突觸重建導(dǎo)致晚期癲癇發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示STIM1和ORAI1的表達(dá)上調(diào)與大鼠PTE發(fā)作密切相關(guān)。通過對(duì)國(guó)內(nèi)外對(duì)CRAC通道功能及PTE相關(guān)機(jī)制研究的分析，結(jié)合本研究結(jié)果，鐵離子致傷后可能通過STIM1和ORAI1的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致CRAC通道大量開放，過度鈣內(nèi)流引起神經(jīng)元異常放電、膠質(zhì)瘢痕形成、突觸重建，最終誘發(fā)外傷性癲癇。需要指出的是，本研究目前只能反映CRAC通道與PTE的相關(guān)性，這是本文的不足之處。在后期實(shí)驗(yàn)中，我們將通過阻斷CRAC通道，觀察PTE大鼠行為學(xué)的變化，并同步檢測(cè)神經(jīng)元膜電位、CRAC通道電位及鈣離子濃度的變化等研究，來(lái)進(jìn)一步探討CRAC通道異常導(dǎo)致PTE發(fā)生的具體機(jī)制。

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