李梓萌潘超盧天蘭阮燕燕朱日升王力芳閻浩岳偉華張岱

精神分裂癥是一種臨床表現(xiàn)復雜、病因尚不明確的重性精神疾病。到目前為止，已報道精神分裂癥的易感基因達1000多個[1]，但不同研究得到陽性驗證的易感基因為數(shù)不多。因此，研究人員更為關(guān)注精神分裂癥的生物學標記。已有研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者眼球軌跡運動異常可能是該病的生物學標記之一[2]，本課題組成員前期研究也已發(fā)現(xiàn)，探究性眼球軌跡運動（exploratory eye movement，EEM）異?？赡苁蔷穹至寻Y的生物學標記之一[3]。但通過探索EEM相關(guān)易感基因以闡釋精神分裂癥發(fā)病機制的報道仍屬罕見。課題組前期發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中表皮生長因子4（V－erb－b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4,ERBB4）基因多態(tài)性與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)[4]，但對于ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)尚未見文獻報道。因此本研究對139例中國漢族人群精神分裂癥患者進行了ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)研究。

1 對象和方法

1.1 研究對象來自北京大學第六醫(yī)院2003年11月至2004年12月住院的精神分裂癥患者。入組標準：①符合《美國精神障礙診斷統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders－IV，DSM－IV）精神分裂癥的診斷標準，由兩名以上精神科醫(yī)師（其中至少一名為主治醫(yī)師）獨立診斷，且診斷一致；②漢族；③患者本人及其法定監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標準：符合DSM－IV診斷標準的其他軸I精神障礙診斷，患有嚴重軀體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、有頭部外傷史。本研究共入組139例精神分裂癥患者，其中男性69例，女性70例；年齡16～49歲，平均（29.2±8.7）歲；受教育年限9～21年，平均（13.1±2.8）年；病程 1～360個月，中位數(shù)48個月；陽性和陰性癥狀評定量表（positive and negative symptom scale，PANSS）總分（76.96±17.85）分，其中陽性癥狀（22.61±7.09）分，陰性癥狀（19.37±6.98）分，一般精神病理癥狀（35.25±9.05）分；服用抗精神病藥物的劑量（氯丙嗪當量）為（506.22±284.04）mg/d。本研究已獲得北京大學第六醫(yī)院倫理委員會的審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 探究性眼球軌跡運動檢查 應用眼球軌跡運動標記記錄儀（型號：NAC－8，日本提供）對139例患者進行探究性眼球軌跡運動檢查，詳細實驗原理及指標評定方法參見文獻[5－6]。

實驗步驟：受試者頭部戴檢查裝置，裝置兩側(cè)各裝有微型紅外線光源，此光源以“＋”為標記反映眼球活動，并顯示在監(jiān)視器上。裝置前上方的自動照相機鏡頭記錄患者正前方屏幕上的投影圖像，并將實驗資料記錄于錄像帶上。檢查時受試者前方1.5m的屏幕上會依次呈現(xiàn)三個水平放置的“S”圖形（S1、S2、S3），記錄儀記錄受試者觀看該圖形時的眼球軌跡運動。首先，放映圖S115s，要求受試者即刻畫出該圖形；其次，分別放映與圖S1稍有不同的圖S2和圖S3各15s，要求受試者分別予以比較并回答異同之處；第三，再次放映圖S115s，要求受試者再次畫出該圖形。檢查在患者住院一周內(nèi)完成，以保證檢查結(jié)果的客觀一致性。

評定方法：本研究選用反應性探究分（responsive search score,RSS）和認知性探究分（cognitive search score,CSS）作為兩項主要評定指標。RSS評定方法：將圖S2和圖S3各分成7個區(qū)域，要求受試者分別注視兩幅圖各5s，再與圖S1作回憶性比較；當檢查者最后追問“還有什么不同嗎？”，受試者講出“沒有了”時，立即計算受試者在此5s內(nèi)注視圖S2和圖S3各個區(qū)域的點數(shù)，每點記一分，兩幅圖總分最多14分。CSS評定方法：要求受試者分別注視圖S2和圖S3各15s，再與圖S1作回憶性比較；將圖S2和圖S3共分成9個部分，凡是對圖的兩端和兩個附著物中的任何部分注視點在3個或3個以上即可記1分，兩幅圖總分最多9分。

1.2.2 ERBB4基因型檢測 抽取所有患者外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝管中，分裝血漿和血細胞后保存于－80℃冰箱，采用Qiagen公司生產(chǎn)小量血液基因組DNA抽提試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）提取全基因組DNA，－80℃保存待用。

本研究前期采用Illumina HumanHap610單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）芯片，分別對746例患者和1 599例對照的620 901個SNP進行基因分型及精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)研究[7]。本研究僅對其中139例接受過EEM檢測的精神分裂癥患者ERBB4基因的447個SNPs位點的基因型信息進行EEM與ERBB4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析。ERBB4基因的447個SNPs位點中，345個SNPs位于ERBB4基因的內(nèi)含子區(qū)，102個SNPs位于ERBB4基因的3’UTR區(qū)，各SNPs位點相關(guān)遺傳信息詳細注釋參見Illumina網(wǎng)站Human-Hap610 SNP芯片（www.illumina.com）。

1.3 統(tǒng)計學方法采用PLINK v1.07軟件對ERBB4基因447個SNPs位點及EEM參數(shù)進行數(shù)量性狀位點分析（quantitative trait locus,QTL），方法為多元線性回歸分析（檢驗統(tǒng)計量為Wald檢驗的R2值）。多重檢驗校正采用陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率（Positive false discovery rate，pFDR）法，校正后檢驗水準要求q＜0.2[8]。采用SPSS v16.0進行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計學描述。采用 QUANTO 1.2.4軟件（http://hydra.usc.edu/gxe），估算目前樣本量（n＝139例）的統(tǒng)計效能。

2 結(jié)果

2.1 精神分裂癥患者的EEM結(jié)果 反應性探究分（RSS）范圍為5～11分，平均（8.22±1.56）分；認知性探究分（CSS）范圍為2～7分，平均（5.06±0.97）分。

2.2 精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因位點的關(guān)聯(lián)結(jié)果 采用QUANTO 1.2.4軟件計算目前樣本量（n＝139例）的統(tǒng)計效能，設患病率為1%、少見等位基因頻率（MAF）為0.2、變異系數(shù)R2為0.05、I類錯誤率α為0.05，估算統(tǒng)計效能約為76%。對EEM與ERBB4基因447個SNPs進行QTL關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與精神分裂癥患者EEM的RSS和CSS同時關(guān)聯(lián)的SNPs位點共有7個，分別為rs12619728，rs17737553，rs1344906，rs10168717，rs10165449，rs10932380，rs7594456，詳見表1。不同基因型攜帶者之間的RSS和CSS指標差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且經(jīng)多重檢驗陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率（pFDR）校正，仍有統(tǒng)計學意義（q＜0.2）。詳見表2。

表1 與精神分裂癥患者EEM的RSS及CSS同時關(guān)聯(lián)的ERBB4基因的7個SNPs位點信息

3 討論

眼球運動檢查對精神障礙的研究已有百余年的歷史，Diefendorf和Dodge等在1908年首次提出精神分裂癥患者在注視一個特定的移動目標時存在障礙[9]。Holzman等于1973年首次報道精神分裂癥患者存在眼球軌跡運動功能的障礙[6]。近十年來，國內(nèi)外對此做了大量的研究，均顯示大多數(shù)精神分裂癥患者存在眼球軌跡運動異常[2,10]。目前國際應用的眼球軌跡運動檢查主要有三種類型：一類是平穩(wěn)視蹤眼球運動（smooth pursuit eye movement,SPEM）；第二類是掃視眼球運動（saccade eye movement,SEM）；第三類是探究性眼球軌跡運動（exploratory eye tracking movement,EEM）。有研究提示，EEM可能是精神分裂癥的生物學標記之一[5,10]，但其機制不詳。

到目前為止，國外有若干關(guān)于精神分裂癥患者眼球軌跡運動與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者SPEM和SEM關(guān)聯(lián)[11－12]，但至今尚無文獻報道ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM的關(guān)聯(lián)，因此本研究對精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因多態(tài)性進行了關(guān)聯(lián)研究。有文獻報道，RSS的改變對精神分裂癥有特征性意義，被認為對遺傳學研究有重要價值[6,13－14]。并且RSS和CSS可以反映患者認識、記憶以及信息加工等方面的認知功能。本研究選取EEM的RSS和CSS指標可能也反映了精神分裂癥患者認知功能障礙的某種機制。有文獻報道，抗精神病藥物、病程長短以及臨床癥狀對EEM影響不大[3,15]，因此可排除上述因素對本研究結(jié)果的影響。

表2 精神分裂癥患者EEM的RSS、CSS指標與ERBB4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者SPEM和SEM關(guān)聯(lián)[11－12]，提示ERBB4基因多態(tài)性可能與眼球軌跡運動的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制相關(guān)。ERBB4基因位于染色體2q34，含有28個外顯子，編碼一種跨膜酪氨酸激酶，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)素1（neuregulin 1,NRG1）的受體，在精神分裂癥的神經(jīng)發(fā)育過程（尤其是突觸成熟及神經(jīng)元遷移）中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16－17]。課題組前期已發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中ERBB4基因的兩個內(nèi)含子多態(tài)性位點與精神分裂癥有統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)（rs6435689：P＝0.009；rs11887531：P＝0.008）[4]，提示 ERBB4 可能參與調(diào)節(jié)精神分裂癥的發(fā)病機制。本研究基于前期精神分裂癥的全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果[7]，提取了精神分裂癥患者ERBB4基因的447個SNPs位點的基因型信息進行EEM與ERBB4基因各SNPs的QTL關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)ERBB4基因上的7個SNPs位點與精神分裂癥患者EEM的RSS和CSS指標同時關(guān)聯(lián)，分別為 rs12619728、rs17737553、rs1344906、rs10168717、rs10165449、rs10932380和 rs7594456（p＜0.05），且經(jīng)多重檢驗陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率（pFDR）校正，仍有統(tǒng)計學意義（q＜0.2）。盡管這一發(fā)現(xiàn)與課題組前期所發(fā)現(xiàn)的精神分裂癥的疾病關(guān)聯(lián)位點（rs6435689、rs11887531）不同[4]，但課題組前期發(fā)現(xiàn)ERBB4基因的兩個內(nèi)含子SNPs位點（rs6435689、rs11887531，位于本研究發(fā)現(xiàn)陽性關(guān)聯(lián)位點的下游）與精神分裂癥發(fā)病風險有關(guān)聯(lián)，在一定程度上反映了該基因及其所在染色體區(qū)域可能存在精神分裂癥發(fā)病風險及眼動異常關(guān)聯(lián)的遺傳基礎，進一步驗證了ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM關(guān)聯(lián)的假說，但其機制需要進一步探索。然而，本研究沒有能夠重復Bae等[11]報道的韓國人群中精神分裂癥患者眼球軌跡運動與ERBB4的SNP（rs7598440）關(guān)聯(lián)的結(jié)論，原因可能與不同種族遺傳背景差異以及眼球軌跡運動檢查類型不同有關(guān)。

總之，本研究對漢族精神分裂癥患者進行的ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果提示ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM顯著關(guān)聯(lián)，驗證了EEM可能是精神分裂癥的生物學標記之一，并與精神分裂癥的易感基因關(guān)聯(lián)。上述發(fā)現(xiàn)仍需在其他人群中進一步驗證ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)。本研究設計僅對精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因多態(tài)性進行了關(guān)聯(lián)研究，未設置正常對照，因此未能得出EEM異常可能是精神分裂癥患者特定的生物學標記的結(jié)論[6]，將來擬增加正常對照組以驗證該結(jié)論。

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