馬 驛 ，彭金菊，王 蕓，陳法霖，陳進(jìn)軍，孫永學(xué)

(1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江524088;2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642)

近30年來，氟喹諾酮類(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)的研究進(jìn)展十分迅速，臨床常用的有諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)等10多種藥物。FQs為廣譜殺菌藥(對細(xì)菌、支原體、衣原體等均有作用)，抗菌力強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物感染性疾病的治療。因FQs體內(nèi)原型排泄率大，經(jīng)人畜使用者排泄物進(jìn)入環(huán)境中的范圍廣、量大。對北京污水及地表水測定結(jié)果顯示，污水中含有12種氟喹諾酮類抗生素，濃度12—1208 ng/L，地表水含7種FQs，濃度1.3—535 ng/L［1］。FQs化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，導(dǎo)致其環(huán)境殘留的抗菌生物活性時(shí)間相對較長，F(xiàn)Qs在環(huán)境中持續(xù)地遷移擴(kuò)散，對人類健康形成了不可預(yù)測的潛在風(fēng)險(xiǎn)［2］，Schwarzenbach等［3］稱FQs等新型污染物引起的微污染已成為“人類面臨的重大環(huán)境問題之一”。環(huán)丙沙星對植物的影響已有報(bào)道［4］。

土壤微生物量碳作為土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍和最易變化的組分，能在很大程度上反映土壤質(zhì)量和土壤微生物數(shù)量，因而是評價(jià)土壤微生物量和活性的重要指標(biāo)［5］。土壤微生物碳源利用率和碳代謝多樣性，能反映生態(tài)系統(tǒng)受干擾后的細(xì)微變化，是土壤生物肥力的重要指標(biāo)，對土壤管理有重要的指示作用［6］。目前，重視分子生物學(xué)方法分析微生物群落功能多樣性，但分子生物學(xué)方法要求的勞動(dòng)強(qiáng)度大、時(shí)間長、技術(shù)含量較高，難以在較短的時(shí)間內(nèi)分析較多的樣品，以Biolog微孔板碳源利用為基礎(chǔ)的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、更為快速的方法［6-7］。土壤微生物對Biolog微平板中各類碳源的利用情況的差異反應(yīng)了土壤中微生物群落代謝功能的不同，平均每孔顏色變化率(AWCD)是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了土壤微生物活性、微生物群落的反應(yīng)速度和反應(yīng)程度，已廣泛應(yīng)用于評價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性［8-10］。本試驗(yàn)通過在土壤中添加不同濃度環(huán)丙沙星，借助氯仿熏蒸浸提法和Biolog法，分析土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性，明確土壤微生物群落碳代謝的變化方向和程度，了解環(huán)丙沙星對土壤微生物群落的影響強(qiáng)度，以揭示環(huán)丙沙星在環(huán)境中殘留對土壤微生物學(xué)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤

培養(yǎng)土壤采自廣東海洋大學(xué)花園苗圃10—20 cm土層的土壤，為磚紅壤，土有機(jī)質(zhì)28.5 g/kg，全氮1.82 g/kg，全磷1.31 g/kg，全鉀23.6 g/kg，速效磷14.5 mg/kg，速效鉀145 mg/kg，pH值6.75。

采集的新鮮土樣過4 mm篩，用濕紗布蓋于土表于室溫下放置3d，待微生物活化后，按每5 kg鮮土加入50 mL不同濃度的環(huán)丙沙星溶液(環(huán)丙沙星活性成分含量≥98.5%，浙江國邦獸藥有限公司)，使土壤中環(huán)丙沙星活性成分含量分別為:Ⅰ組(對照組)0μg/g、Ⅱ組0.01μg/g、Ⅲ組0.1μg/g、Ⅳ組1μg/g、Ⅴ組10μg/g、Ⅵ組100μg/g，用去離子水調(diào)土壤濕度至40%的飽和持水量，混合均勻后倒入10 L的塑料桶中，并用濕紗布蓋于土表，置于室溫(20—25℃)下培養(yǎng)35d，用稱重法每隔3d調(diào)節(jié)1次土壤濕度，以保持土壤濕度穩(wěn)定，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2 分析項(xiàng)目及方法

1.2.1 土壤微生物量碳

于處理后21d采取相當(dāng)于20 g烘干質(zhì)量的培養(yǎng)土壤，用氯仿熏蒸浸提法測定土壤微生物量碳［11］。

1.2.2 BIOLOG分析

分別于用藥后7d、21d、35d采集新鮮土壤10 g，加90 mL滅菌生理鹽水(0.85%)，充分振蕩30 min后，稀釋至10-3倍，再吸取150μL接種到Biolog EcoPlate微平板的微池內(nèi)，置于25℃下培養(yǎng)，每12 h在590 nm下BIOLOG讀數(shù)器上讀數(shù)。

平均每孔顏色變化率(AWCD)計(jì)算［12-13］:

式中，C為每個(gè)有培養(yǎng)基微池的光密度值，R為對照孔的光密度值，n為培養(yǎng)基數(shù)據(jù)，EcoPlate板中有31種不同碳源，n值為31。

采用曲線整合方法［14］估計(jì)碳源代謝強(qiáng)度:

梯形面積

式中，vi為i時(shí)刻的AWCD值。

豐富度指數(shù)為被利用的碳源的總數(shù)目，即31個(gè)微池中C-R值大于0.25的微池?cái)?shù)［15］。多樣性指數(shù)用Shannon-Wiener指數(shù)(H')表示:

式中，Pi為有培養(yǎng)基的微池與對照微池的光密度值差與整板總差的比值。

即

本試驗(yàn)采用Biolog微平板培養(yǎng)72h的數(shù)據(jù)，來比較土壤微生物群落的碳源利用及代謝功能多樣性，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物量碳

用環(huán)丙沙星處理后21d土壤中微生物量碳含量如圖1所示，環(huán)丙沙星(0.1—100μg/g)對土壤微生物量碳含量影響顯著(與對照組比較，P＜0.5)，藥物處理組土壤微生物量碳含量均低于對照組，土壤中環(huán)丙沙星濃度愈高，土壤微生物量碳含量愈低。100μg/g的環(huán)丙沙星處理使土壤微生物量碳下降58.69%。

2.2 土壤微生物群落碳代謝多樣性

AWCD是反映土壤微生物活性，即利用碳源的整體能力的一個(gè)重要指標(biāo)［16］。由圖2可知，微生物活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而提高，不同組別土壤微生物利用單一碳源能力的大小順序?yàn)?Ⅰ組＞Ⅱ組＞Ⅲ組＞Ⅳ組＞Ⅴ組＞Ⅵ組。處理后7、21、35d，各處理組土壤微生物的AWCD基本都低于對照組，尤其是Ⅵ組(100μg/g組)降低了56.56%—78.94%。

培養(yǎng)基豐富度指數(shù)反映的是微生物利用碳源的數(shù)量，培養(yǎng)基Shannon-Wiener多樣性指數(shù)表明的是土壤微生物群落利用碳源類型的多與少，即功能多樣性。土壤微生物群落代謝功能豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)與藥物濃度的變化情況(表1)為:

第7天，對照組的豐富度指數(shù)與0.1、1、10、100μg/g組差異顯著;第21天、35天，100μg/g組的豐富度指數(shù)與對照組差異顯著。

第7天、21天，對照組的多樣性指數(shù)與10、100μg/g組差異顯著;第35天，對照組的多樣性指數(shù)與其他各組之間差異不顯著。

2.3 土壤微生物對碳源的利用強(qiáng)度

AWCD曲線的積分面積反映了土壤微生物群落在Biolog微平板整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)利用碳源能力的差異，本研究采用AWCD曲線整合方法估計(jì)土壤微生物群落的代謝強(qiáng)度。環(huán)丙沙星含量不同，土壤微生物對碳源的利用強(qiáng)度不同(圖3)，第7天，對照組土壤微生物對碳源的利用強(qiáng)度最大，與用藥各組均差異顯著;第21天、35天，10、100μg/g組土壤微生物對碳源的利用強(qiáng)度與對照組差異顯著。

圖1 處理后21d土壤微生物量碳含量Fig．1 Contents of soil microbial biomass carbon(MBC)for each treatment after 21 days

圖2 處理后7d土壤平均顏色變化率Fig．2 Average well colour development in soil from different treatments after 7 days

表1 土壤微生物利用Biolog微平板碳源的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)Table1 Richness indexes and diversity indexes of utilized substrates for each treatment

2.4 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

31種碳源的測定結(jié)果形成了描述微生物群落代謝特征的多元向量，不易直觀比較，對31種碳源進(jìn)行主成分分析結(jié)果表明:土壤微生物群落的代謝多樣性類型分異明顯。第7天(圖4)，第一主成分和第二主成分得分系數(shù)的差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，土壤中環(huán)丙沙星wCIP≥0.01μg/g與對照組差異顯著;第21天，第一主成分和第二主成分得分系數(shù)的差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，土壤中環(huán)丙沙星wCIP≥1μg/g與對照組差異顯著;第35天，第一主成分得分系數(shù)的差異達(dá)顯著水平(P＜0.001)，土壤中環(huán)丙沙星wCIP=100μg/g與對照組在主成分1上差異顯著。

2.5 不同處理土壤微生物對6類碳源的利用率

試驗(yàn)用31種碳源可分為6類，對6類碳源分別計(jì)算，其平均吸光值可直接反映土壤微生物對不同碳源的利用率。第21天，各組的土壤微生物對6類碳源的利用情況存在差異(表2)。藥物處理組碳水化合物、羧酸、氨基酸、聚合物、酚類和胺類的平均吸光值均低于對照組，100μg/g組土壤微生物對6類碳源的平均吸光值均與對照組差異顯著。

圖3 不同濃度環(huán)丙沙星處理下土壤微生物群落利用碳源的強(qiáng)度Fig．3 Carbon metabolic intensity of soil microbial communities for each treatment

圖4 處理后7d土壤微生物群落主成分分析Fig．4 Principal components analysis on soil microbial communities from different treatments after 7 days

表2 處理后21d土壤微生物對6類碳源的平均吸光值Table2 Average well color development of soil microbes from six carbon sources after 21 days

3 討論

土壤微生物是土壤養(yǎng)分循環(huán)的推動(dòng)力，土壤中的一系列過程以碳、氮循環(huán)為中心，土壤微生物量碳是評價(jià)微生物量和活性參數(shù)的重要指標(biāo)，也是評價(jià)土壤碳庫平衡和土壤化學(xué)、生物化學(xué)肥力保持的重要指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)使土壤微生物量碳含量顯著降低，環(huán)丙沙星是通過干擾菌體DNA的復(fù)制而發(fā)揮特異性抗菌作用，對靜止期和生長期的細(xì)菌均有效，對支原體、大腸桿菌、巴氏桿菌、丹毒絲菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、克雷伯氏菌、彎曲桿菌、氣單胞菌屬、嗜血桿屬、弧菌屬、變形桿菌、布氏桿菌等均有良好的抗菌作用，對部分真菌和放線菌也有抑制作用。環(huán)丙沙星使土壤微生物的數(shù)量和活性大大降低，所以土壤微生物量碳也減少。

試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤中環(huán)丙沙星濃度愈大土壤微生物利用碳源的能力愈低，微生物群落碳代謝功能多樣性也愈低。0.1、1、10μg/g的環(huán)丙沙星處理對土壤微生物群落代謝功能的影響主要體現(xiàn)在用藥第7天、21天，100μg/g的環(huán)丙沙星處理在用藥7、21、35d均顯著影響土壤微生物群落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與恩諾沙星對土壤微生物的碳源利用及代謝功能多樣性影響的結(jié)果一致［17］，用藥3、14d，恩諾沙星含量0.1—100μg/g使土壤微生物群落代謝功能多樣性顯著降低(P＜0.05);第35天，恩諾沙星含量10—100μg/g使土壤微生物群落代謝功能多樣性顯著降低。原因是多方面的，首先，土壤是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)體系，任何一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)展變化都是多因素綜合作用的結(jié)果，各種理化因子如土壤含水量、溫度、pH值、有機(jī)質(zhì)、無機(jī)質(zhì)等均能對環(huán)丙沙星的稀釋、水解、氧化等降解作用有一定影響;其次，各種礦物質(zhì)尤其是Mg2+、Ca2+等金屬離子可與環(huán)丙沙星發(fā)生鰲合，加上土壤對藥物的吸附作用不利于藥物的解離，致使土壤中實(shí)際藥物濃度降低［18］;另外，土壤中微生物、原蟲等土壤生物種類繁多，有些微生物對環(huán)丙沙星不敏感，所以微生物也能降解土壤中的環(huán)丙沙星，從而逐漸恢復(fù)土壤微生物生態(tài)平衡。因此，低濃度藥物組的土壤微生物群落碳代謝功能多樣性與對照組之間的差異變得不顯著。但環(huán)丙沙星化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中降解緩慢［19］，污水處理廠污泥中環(huán)丙沙星的含量達(dá)1.96 mg/kg，將這種污泥施入土壤8個(gè)月后，環(huán)丙沙星含量為0.32 mg/kg，21個(gè)月后含量為0.3 mg/kg［20］，如果藥物在土壤中長期殘留，其對生態(tài)環(huán)境的影響不容忽視。

金彩霞［3］等研究了環(huán)丙沙星對作物發(fā)芽的生態(tài)毒性效應(yīng)，環(huán)丙沙星抑制小麥、白菜、番茄的種子發(fā)芽率、根伸長和芽伸長，本研究表明環(huán)丙沙星影響土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性。獸藥進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，不僅對陸生植物、土壤微生物造成影響，還影響土壤動(dòng)物、原生生物，以及水生生物中的浮游類生物、微生物、魚蝦及水體甲殼動(dòng)物等［21-23］。為了確保生態(tài)環(huán)境安全，應(yīng)加強(qiáng)獸藥安全使用，結(jié)合獸藥暴露與效應(yīng)兩方面進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估尤其重要［24］。

4 結(jié)論

環(huán)丙沙星對土壤微生物量碳和微生物群落碳代謝多樣性有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的增高而影響加大。本研究結(jié)果表明，環(huán)丙沙星(wCIP≥0.1μg/g)顯著降低土壤微生物量碳含量、土壤微生物對各類碳源的利用率、土壤微生物碳代謝強(qiáng)度和代謝多樣性，其中100μg/g的環(huán)丙沙星處理影響最大，使土壤微生物量碳下降58.69%，土壤微生物利用單一碳源能力降低56.56%—78.94%。同時(shí)，環(huán)丙沙星對土壤微生物群落碳代謝多樣性的抑制作用還表現(xiàn)出時(shí)間差異，0.1、1、10μg/g的環(huán)丙沙星處理對土壤微生物群落碳代謝功能的影響主要表現(xiàn)在處理前期(用藥第7天、21天)，這種影響在處理后期(用藥第35天)表現(xiàn)不明顯，100μg/g的環(huán)丙沙星在用藥的前期和后期均顯著影響土壤微生物群落碳代謝功能。

致謝:本研究在中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，謹(jǐn)致謝忱。

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