陳文榮，葉杰君，李永強，張真真，曹詣斌，郭衛(wèi)東

(浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 321004)

低溫是影響經(jīng)濟作物產量和品質的主要環(huán)境因素之一。植物經(jīng)低溫脅迫后，植物脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等兼容滲透劑大量積累，從而改變了原有的細胞壁結構以及脂質膜和碳水化合物的組成[1]。同時，低溫脅迫能夠誘導植物體內某些基因的表達，這些基因的表達蛋白可能直接參與低溫脅迫的應答或者間接調控其他靶基因的表達[2]。Weiser[3]早在1970年就提出植物抗寒性誘導過程中基因表達改變的觀點，指出多年生木本植物的低溫適應性可能需要兩個條件，即特異基因的轉錄激活和在最大抗寒過程中新蛋白質的低溫誘導合成。陳香波等[4]列表總結了從擬南芥、黑麥、歐洲油菜、大麥、菠菜、小麥、苜蓿、馬鈴薯等鑒定分離出與植物抗寒性有關的低溫誘導基因62個，并指出這些基因的功能與抗冰凍脫水、膜脂相變、低溫下酶活性以及“抗凍活性”有關。

柑橘屬(Citrus)植物的果實是世界第一大水果類別，我國的柑橘產量位居世界第一。柑橘屬植物是亞熱帶植物，性喜溫暖，對低溫反應敏感，所以溫度是影響柑橘屬植物產量和品質的一個重要氣候因素。佛手(Citrusmedicavar.sarcodactylisSwingle)是蕓香科柑橘屬香櫞的變種，其果型奇特，具有較高的觀賞和藥用價值，也是中國特色的物種。但是由于佛手抗寒性差，植株半致死溫度為-4℃左右[5]，低溫凍害后其品質和產量均會受到影響。研究表明，低溫脅迫下佛手的ERF6基因[6]和GRAS基因[7]的表達量發(fā)生明顯的變化，低溫對兩種基因的表達均有誘導作用。由于抗寒性差的原因，佛手的栽培地局限在亞熱帶北緣以南地區(qū)，這很大程度的限制了佛手在我國北方廣大地區(qū)的栽培、種植和佛手產業(yè)的發(fā)展。

目前，對寒敏感柑橘類植物的研究很少[8]，對佛手等寒敏感柑橘類植物對低溫應答的分子途徑、低溫誘導特異基因的表達變化情況和引起寒敏感的分子機理少有報道。本文以浙江金華地區(qū)佛手主栽品種青皮佛手為試材，采用mRNA差異顯示技術獲得佛手低溫脅迫前后差異表達的cDNA片段，BLAST確定其功能后，采用半定量PCR技術確定這些基因在佛手低溫脅迫前后的表達量變化情況，從而獲得寒敏感佛手低溫脅迫相關基因，分析低溫應答分子機制。通過本研究為佛手寒敏感基因的獲得和寒敏感機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取長勢一致的2年生青皮佛手(C.medicacv. Qingpi)盆栽苗，采自浙江師范大學佛手實驗基地——浙江錦林佛手有限公司。在人工氣候室進行預培養(yǎng)及抗寒鍛煉，溫度設置參照劉祖祺等的方法，預培養(yǎng)溫度為20(黑夜)/28(白天) ℃，光照每天14 h，光照強度100 μmol·m-2·s-1，濕度75%，定期澆水；預培養(yǎng)3周后在2 d時間內將溫度緩慢降至4 ℃進行冷鍛煉7d。

1.2 低溫處理

隨機選取3盆青皮佛手盆栽苗移入冷庫，處理條件為溫度-4 ℃，光照14 h，濕度75%，溫度控制精度為±0. ℃1，處理時間為24 h。取完整、無病蟲害的自當年生春夏梢頂向下數(shù)第5—11葉位的7張葉片用于后續(xù)實驗。

1.3 DDRT-PCR分析

1.3.1 DDRT-PCR引物及內參引物的設計

mRNA差異顯示分析引物按Genhunter Corporation RNA imageTM Kit 序列進行設計，引物序列見表1。引物由上海invitrogen合成。

表1 錨定引物、隨機引物及內參引物列表

1.3.2 總RNA提取及mRNA純化

采用Trizol試劑盒(invitrogen)提取葉片總RNA，DNAase消化去除基因組DNA，并采用OligotexTM-d(T)30 mRNA 純化試劑盒(TaKaRa)對提取的總RNA進行mRNA純化。

1.3.3 cDNA第一鏈合成

純化得到的mRNA應用3種錨定引物(H-T11G，H-T11C， H-T11A)參照invitrogen的SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase進行mRNA反轉錄得到cDNA。

1.3.4 DDRT-PCR擴增

將3′錨定引物3條，5′隨機引物8條，共24對引物組合，分別進行PCR擴增。擴增體系和程序主要參考Liang等1992年提供的方法，略加更改。25 μL反應體系中含10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 2.5 μL、dNTP(2.5mmol/L each) 2 μL、錨定引物(20 μmol/L)和隨機引物(20 μmol/L) 各2.0 μL、TAKARA Taq(5 U/μL) 0.2 μL以及2 μLcDNA模板溶液，加無菌純水補充總體積至25 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，然后進行94 ℃變性30 s，40 ℃退火2 min、72 ℃延伸1 min的循環(huán)反應，共40個循環(huán)，最后于72 ℃下延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.5 差異片段的分離及回收

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異片段，銀染顯色。從銀染結果中選取差異表達的條帶進行回收，選取的標準是，處理和對照條帶同一高度上有無差異和明顯的表達量差異。聚丙烯酰胺凝膠回收使用BioFlux的Biospin聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒進行。

1.3.6 差異片段的重擴及回收

直接取回收的差異片段2 μL作為模板，選擇對應的引物組合，進行二次擴增，PCR的體系與程序與上文中相同。重擴后1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測重擴后的條帶是否與回收的條帶片段大小相同，如是同一條帶進行瓊脂樣凝膠的回收。瓊脂糖凝膠回收用的試劑盒是上海生工生產的UNIQ-10 DNA膠回收試劑盒(SK1131)回收和純化目的片段。

1.4 差異片段的克隆

采用氯化鈣2次重懸法制備JM109感受態(tài)細胞，回收的差異片段與pMD18-T Simple Vector(TaKaRa)16 ℃進行連接，連接產物轉入JM109感受態(tài)細胞，菌液涂平板后挑取單菌斑培養(yǎng)，做菌液PCR檢測對重組子進行陽性鑒定，反應體系和程序和生成目的片段的PCR反應一致。

1.5 陽性轉化重組子的測序和序列的生物信息學分析

陽性克隆子的測序工作由上海英駿生物工程技術服務有限公司(Invitrogen,China)商業(yè)化完成，采用通用引物M13F/M13R組合起始測序。序列對比在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上，進行BLASTx和BLASTn分析。

1.6 半定量RT-PCR鑒定目的基因表達量差異

1.6.1 引物設計

β-actin引物參考Genbank中已發(fā)表的序列，設計兼并引物，在佛手cDNA中擴增出目的片段后，克隆、測序，再設計特異引物，設計的佛手特異引物序列為：Sense：TGCCATCCACGCCGTTCTATCT，Antisense：ATCACGACCAGCCAAGTCCAAA，引物均采用primer primer5設計，由上海生物工程有限公司合成。

1.6.2 半定量RT-PCR反應條件的確定

以cDNA為模板，目的基因引物對和β-actin在異管同臺PCR中進行反應，設置不同的循環(huán)數(shù)，22、24、26、28、30、32、34、36個循環(huán)數(shù)，確定合適的條件，保證擴增均處于線性期。PCR反應程序參數(shù)為94 ℃預變性5 min，然后進行94 ℃變性30 s，50—60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s的循環(huán)反應，循環(huán)數(shù)為22—36個，最后于72 ℃下延伸5 min，4 ℃保存。

1.6.3 PCR產物的檢測

PCR擴增產物在含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結果在紫外燈下用Bio-red公司成像系統(tǒng)自帶Quantity One軟件進行掃描成像和光密度分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取與檢測結果

提取的總RNA經(jīng)DNA酶消化后在全波長酶標儀(Thermo)上測定OD260/OD280，結果比值均在1.8—2.0之間，說明RNA樣品的純度較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA完整性，電泳結果顯示，28S、18S條帶清晰，無降解，說明總RNA完整性好，可以用于后續(xù)實驗。

2.2 mRNA差異顯示結果

以青皮佛手對照和處理組葉片總RNA為模板，分別用3種錨定引物進行逆轉錄反應，得到6種cDNA；再以這6種cDNA為模板，3種錨定引物與8種隨機引物組合進行PCR擴增。對相同引物組合擴增得到的對照組和處理組的PCR產物進行差異比較。在mRNA差異顯示過程中，聚丙烯酰胺凝膠上24對引物組合在佛手mRNA中共擴增出3000多條cDNA序列。圖1為其中7組引物對擴增出的佛手對照和處理cDNA片段。

通過DDRT-PCR，比較對照組和處理組擴增結果，121條差異表達的cDNA片段被成功克隆和測序。經(jīng)生物信息學分析，差異表達序列中有33條為功能已知序列，88條為未知序列(其中5條具有開放性閱讀框)。

2.3 半定量RT-PCR分析結果

將上述的33條已知差異表達序列及5條具有開放性閱讀框的未知序列進行半定量RT-PCR分析，以進一步確定低溫脅迫前后這些差異表達片段表達量的變化。差異片段進行RT-PCR的引物序列、退火溫度及PCR反應循環(huán)數(shù)見表2。

表2DDRT的產物進行半定量RT-PCR驗證時各產物對應的引物序列、退火溫度和循環(huán)數(shù)

Table2Oligonucleotideprimersequences,PCRconditionsandcyclenumbersfortheconfirmationofdifferentialdisplay(DD)productswithquantitativerelativereversetranscription(RT)-PCR

差異產物DDproduct正向特異引物序列Forwardpirmer(5′-3′)反向特異引物序列Reversepirmer(5′-3′)PCR退火溫度PCRannealingtemperatuer/℃循環(huán)數(shù)Cyclenumbersβ-actinTGCCATCCACGCCGTTCTATCTATCACGACCAGCCAAGTCCAAA55301-C1AAGGTTGATTGCCTCTACATTGCATAGCGGTTCCGTCCC55282-G2GATTTCGGTCCTATTCTGTTGGTTTCGCAGTTGTTCGTCTTTC55362-C7ACAACTCTAAAACCTTCGGGGTGCCTTCCACTTTCAATAA50283-G1GATTGCCACACTTCCCACATGACCCAAACACCCAACACAT55303-G15CCCCCTTGCTTGTCAACCTGCAACATTCGTCAACGCTCCG60323-G24GCTGAAGAGTTGAGAAAGAAGACAAGACATTGAAAATAAGAAGAAAAA50363-G17GTTGACTGCTTGTCCTCTCCCGCTTCCTCTGTCCCCTCCTTGGT55343-G19AGCGAACTTGAACCCCCGATGCAGCAATGCCAGCAACACA55324-G23TTTGGCAGAACCAGTTACACATCTTCCCAGTTGACATCCT50365-C2TGAGGACATCAAGTTGGAGACAAAGGCAGTTCAAGAAGAAGACG55345-C4GATTGCCGAAATAAGAAGGATGAATGAAGTGGGAAAGAATAAGGAG55325-C15AAAACATCATTGGAGGAACCTGAAGAAACAAAGATTGAAACATA50306-C1TTTGGTTACTTCTTTCTGTCTTGTGCGGTTCCGTCCCTCTT55306-C24TGTTGATTGTAAATGCGACGTTACGGTTCTTTCTCCACGA55306-C22TACCCAAATCTTTCCCCTTTGAAATAGAAGATAACCCTGATAG50366-C19GACCAGGATACATTGATAGGAAGCCAAGCAACCAGGGAAAGACA55326-A5-1ACATAAACTCACCACAGAACGAAGAGGATAGAACACTGTGATAACC55307-3-29GATAATCTGAGCACAACACCGCCACACGAATAGGGAATAATACAACG55367-6-33-1ACCAATCTCTAAGCCACTGCTGCTCAAACATCACACAACC55367-6-5TGTTTTTATTTGCGGACTTTACAAACAACATCATAAATCCAAT50367-6-15ATTGAAAAAACAAAGAAGGGGGAGCACAAAACATACGAAAAGCC55368-3-10GAAAGCATAAAATAAAACTGTGTGTCCCAAACGGGCTCATA55368-3-11GCTTCGGTCAGGCAGGAGAAAACTTAGGCATCATCATAACAAA55348-3-13ACGGTCCTGGAGAGACTTATGCCAATGAGATGAGGCAAACA55288-3-17GGCAGAGGAAAAGAAAGCAAAACGGGTCAGAGCGTAAGGTAGTG55288-6-39-1CTTATTCCGAGTGCTCTGTTTTGTCCGACGACCTTATTTGTATC55347-6-42GCGGTGTTGTGCTCTTATTATAGTTCTCCCTCTATTGCTTTTG50348-3-32TACTTGGATTGATAATAACTAACTTATGTATGCTTGGTCGCC55364-29-3CGTCAGTAACATACACAAGCACAAAAAATAAAAGAGGGCATA55362-G8TTTCGGTCCTATTCTGTTGGCTTTCGCAGTTGTTCGTCTT55366-C30GAGGCAACAACATTTAGCATTTTGTCTACCACTTAGGAGGAGGG55308-4-11-3GTCAGGCAATCCAGCAACTTCAAAGTCAGCGACAAGG50328-6-43GTAGTGGCTGCGGTAGGATAAGGGGCAAAGGAACAT55349-4-18-3ACATTGTTGTTCGGTTTTTTTGAACTGACTTTTGACCAGCATTCT50349-4-20-3AACATTGCCAGCGAACGCGAGGTCTGTAGTGGGTGC50369-4-4-2AAGAAACAAAGACTGAAACATATGGAGGAACCACAGAAATAATA5030G22TTTGGAGAGGGTAAAAAGGGTGCAATAGGAAAGTAGCAGTGTT50365-C7CGAGAAGAGAGGAGCCGTGGGGAGGATAGATGGGGCGATT5530

為了提高半定量RT-PCR的準確性，每個差異片段做不同模板來源重復，PCR板內重復和不同批次PCR重復，只有這3個重復表達趨勢一致的差異片段才被視為陽性。每一批次的PCR反應都帶有內參β-actin，并在同一塊瓊脂糖凝膠上成像，只有同塊膠上的β-actin表達量一致的，才記做1個重復，這樣可以盡可能的減少凝膠成像上所帶來的假陽性。

根據(jù)半定量RT-PCR分析鑒定，38個差異片段中有4個是假陽性片段，34個陽性片段。在通過鑒定的陽性片段中，有29個差異片段低溫脅迫前后表達量上調，其表達量變化見圖2；有5個差異片段低溫脅迫前后表達量下調，其表達量變化見圖3。

圖2 29個上調基因經(jīng)過半定量RT-PCR分析后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 5個下調基因經(jīng)過半定量RT-PCR分析后的瓊脂糖凝膠電泳圖

將這34個陽性差異片段根據(jù)其對應的功能和寒脅迫的關系進行分類，可分為植物逆境應答、新陳代謝、細胞壁重建、信號轉導、氧化應激、轉錄調節(jié)、蛋白、脂肪和糖合成和轉運、未知功能蛋白，共8類，其對應功能、分類情況和序列信息見表3。

表3 DD產物對應功能列表

續(xù)表

DDProduct長度Length/bp引物Primers表達水平(與actin比值)Expressionlevel功能FunceionEG19720T11G+AP54．47±0．252葉綠素酶1Chlorophyllase-19×10-484-G23847T11G+AP60．163±0．008向光素phototropins3×10-748-3-11270T11C+AP35．77±0．208NADH脫氫酶亞單位5NADHdehydrogenasesubunit57．0細胞壁重建Cellwallmodification7-6-33-1376T11A+AP64．37±0．569伸展蛋白extensin-likeprotein1．17-6-5180T11A+AP16．5±0．5纖維素合酶蛋白cellulosesynthaseprotein9．07-3-29419T11C+AP815．3±0．3葡聚糖轉葡糖苷酶(XET)xyloglucanendotransglycosylase5×10-14信號轉導Signaltransduction5-C4270T11C+AP16．67±0．862蛋白磷酸酯酶2Cphosphatase2C-relatedprotein0．0153-G24308T11G+AP64．97±0．416鈣調素結合蛋白calmodulin-bindingprotein3×10-8轉錄調節(jié)Transcription8-3-32231T11C+AP83．08±0．225細胞周期檢查點蛋白mitoticcheckpointfamilyprotein5．62-G8458T11G+AP73．8±0．458鳥苷戴帽酶α亞基mRNAcappingenzymesubunitα5．6抗氧化性Oxidativeresistance8-3-10175T11C+AP314．97±0．351過氧化物酶peroxidase1×10-598-4-29-3370T11A+AP88．37±0．153硫氧還原酶蛋白thioredoxinfamilyprotein1×10-16蛋白、脂肪和糖合成和轉運Protein，fatandcarbohydratesynthesisandtransduction3-G1653T11G+AP113．40±0．173延伸因子elongationfactorprotein3×10-426-C22211T11C+AP66．37±0．231ABC轉運體蛋白ABCtransporterfamilyprotein4×10-135-C7243T11C+AP20．087±0．004氨酰tRNA合成酶Aminoacyl-tRNAsynthetases2×10-991-C1217T11C+AP16．10±0．265亞精胺/腐胺轉運系統(tǒng)通透酶potBspermidine/putrescinetransportsystempermeasePotB9．06-A5-1376T11A+AP712．30±0．173半乳糖轉移酶galactosyltransferasefamilyprotein3．2未知功能Unknownfunction8-6-43199T11A+AP75．53±0．208未知unknownfunction9-4-20-3191T11A+AP26．10±0．265未知unknownfunctionG22270T11G+AP55．27±0．058未知unknownfunction

3 討論

低溫脅迫容易引起植物光合、呼吸作用關鍵基因的表達下調，同時植物生長停滯以保證代謝所需的碳水化合物及能量；植物抗冷機制還包括細胞物理結構(質膜組成和細胞骨架)的適應性發(fā)變、胞內滲透保護物質(脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖)大量積累[1]、抗氧化劑的合成水平上升；使植物恢復物質與能量代謝平衡。植物對冷脅迫的應答過程中發(fā)生的一系列生理、生化變化，是復雜的內在分子機制調控的結果，涉及大量的基因在表達模式、轉錄水平及轉錄后修飾方式等方面發(fā)生變化，但不同植物對低溫脅迫的應答機制也存在著一定的差異[2]。揭示植物在逆境下所表現(xiàn)出的復雜的基因表達變化情況，對于正確解答植物對逆境的應答機制有非常重要的科學意義。

相對于枳等耐寒的柑桔屬植物，佛手對低溫脅迫較敏感，-4 ℃低溫處理后，嫩葉出現(xiàn)萎蔫等典型癥狀[5]。本研究通過mRNA差異顯示技術篩選和半定量RT-PCR技術驗證，獲得了34個陽性差異cDNA片段。這34個佛手低溫脅迫相關基因，根據(jù)其功能的歸屬大致可分為以下幾類：8個與植物組織抵御相關基因、9個與光合作用或其他代謝相關基因、3個細胞壁代謝相關基因、5個與蛋白、脂肪和糖合成和轉運相關基因、2個與信號轉導相關基因、2個與抗氧化相關基因、2個與轉錄調節(jié)相關基因和3個功能未知基因。以下探討其中一部分關鍵基因的功能和應答機理。

3.1 光合作用相關基因

低溫使得生物膜結構發(fā)生顯著變化，進而導致植物體內新陳代謝的有序性被打破，特別是光合作用受到影響。植物葉綠體的類囊體膜在光下催化ADP形成ATP的反應，有兩種類型：循環(huán)式光合磷酸化(cyclic photophosphorylation)和非循環(huán)式光合磷酸化。在34個佛手低溫脅迫相關基因中，有4個基因對應蛋白功能與循環(huán)式光合磷酸化的光合鏈相關：6-C19(類囊體蛋白ALB2、ALB3,Ablinteractor-like protein-2、3)、6-C1(P700)、2-G2(質體藍素蛋白,plastocyanin-like protein)、7-6-15(細胞色素f,cytochrome f)。半定量PCR結果表明，佛手的Ablinteractor-like和P700，在低溫脅迫后表達量明顯下調；plastocyanin-like和cytochromef表達量略微上調。這些基因在低溫脅迫后表達量的變化，說明佛手在低溫逆境中其循環(huán)式光合磷酸化途徑受到了影響，進而影響到佛手的光合作用，這可能是低溫造成佛手光合能力下降的原因之一。

除此之外，在佛手低溫脅迫下獲得的光合相關基因片段還有8-4-11-3、G19、8-3-17、8-3-17、4-G23分別同源于γ碳酸酐酶(γ-type carbonic anhydrase protein)、葉綠素酶1(Chlorophyllase-1)、ATP合酶CFO亞基I(ATP synthase CF0 subunit I)及向光素(phototropins)基因。其中γ碳酸酐酶和葉綠素酶對應的片段在低溫脅迫后表達量增加。碳酸酐酶被認為在逆境條件下參與了光合速率的調節(jié)，Downton和Slatyer[9]認為在干旱或高溫條件下光合速率的變化與碳酸酐酶活性的變化有一定的相關性。葉綠素酶1的作用是降解葉綠素，低溫脅迫能使原有的葉綠素受到破壞而降解，本研究中佛手葉綠素酶1基因表達量的增加，可能是用于水解低溫下受破壞的佛手葉綠素。ATP合酶CFO亞基Ⅰ和向光素對應的佛手差異片段在低溫脅迫后表達量減少，魏家綿等[10]研究表明，葉綠體中的ATP合酶亞基Ⅰ可以通過與亞基Ⅱ-CF1亞基δ的交聯(lián)會引起光合磷酸化的抑制。向光素能夠結合黃素單核苷酸(FMN)進行自動磷酸化作用，它介導植物向光性運動、葉綠體移動與氣孔開放等反應，在藍光信號傳導反應中它啟動生長素載體的運動和誘導Ca2+的流動，從而調節(jié)植物細胞代謝相關反應。

植物體代謝的重新調整，是植物增加抗性的主要機理之一[11]，而佛手的低溫引起的差異片段中有8個基因與光合作用有關，這就說明了在低溫脅迫下佛手的光合作用受到了很大的影響，從而影響到了佛手的正常代謝。

3.2 植物逆境應答相關基因

低溫脅迫會導致多種基因的應激上調，以應對突如其來的冷害，增加植物對寒冷的抵御能力。在佛手低溫脅迫獲得的差異片段中，有8個與植物逆境應答有關，這些片段經(jīng)BLAST比對后與擬南芥等植物逆境脅迫下表達的、有功能注釋的基因同源，且這些片段在低溫脅迫后均上調。植物通過誘導表達或上調表達一系列基因，在植物逆境應答中降解異常蛋白、修復損傷蛋白、運輸有毒物質、維持細胞平衡，從而增加植物對脅迫環(huán)境的抵御能力。

8-3-13高度同源于擬南芥在輻射和化學試劑誘導下產生的DNA損傷修復蛋白DRT[12]基因，DRT能與脅迫后受到損傷的DNA結合，從而起到對損傷DNA的保護作用[13]。本研究中，佛手DRT的表達量在低溫下明顯增加，有利于了修復低溫脅迫造成的DNA損傷，減輕對植株生長、代謝的影響。

環(huán)境脅迫下，植物會啟動蛋白降解以維持細胞的正常功能[14]。5-C2高度同源于擬南芥26S蛋白酶體亞基(26S proteasome regulatory subunit)的基因。26S蛋白酶體被認為在依賴ATP的非溶酶體降解途徑中起著重要作用[15]，它不僅能破壞不穩(wěn)定的調節(jié)蛋白，而且還能降解長命的組成性表達蛋白；另外，它能快速消除因突變或多種環(huán)境脅迫(如高溫、氧化脅迫和重金屬)造成的結構不正常的蛋白質，部分介導生物的抗逆性[16-17]，因此它在逆境下對維持細胞的生存能力似乎是不可缺少的。佛手低溫脅迫后5-C2的表達量明顯上調，過量的26S 蛋白酶體將對佛手由于低溫脅迫產生的一些不正常的蛋白質進行降解，以提高其對低溫的抵御能力。

硫氰酸酶(Rhodanese domain protein)能使有毒的氰化物轉變?yōu)闊o毒的硫氰酸鹽，具有使植物組織解毒的功能[18]。而在佛手低溫脅迫后明顯上調的6-C30高度同源于擬南芥逆境中高表達的Rhodanesedomain。植物在低溫脅迫下容易積累有毒的中間物質，硫氰酸酶能夠減少其中氰化物對植株造成的傷害。

8-6-39-1同源于擬南芥缺鐵激發(fā)的病原無毒蛋白(Avirulence protein, Avr)基因，此基因的作用機制是與抗性基因R(Resistance gene, 簡稱R基因)相互識別、結合而作用從而增加植物對脅迫環(huán)境的適應性。具體作用機制是R基因的受體蛋白識別特定的avr基因產物，從而激發(fā)含有蛋白激酶的信號傳遞，誘導植物抗性表達[19]。

轉座酶(Ac-like transposase protein)和逆轉座子蛋白(Retrotransposon-like protein)都被認為和植物的脅迫抗性有一定關系，7-6-42同源于擬南芥的Ac-liketransposase，3-G17同源于水稻的Retrotransposon-like，它們在佛手低溫脅迫后表達量都明顯增加。轉座酶與抗病基因核糖體蛋白S5(RPS5)有一定關系[20]，而逆轉座子蛋白與水稻[21]、小麥[22]、玉米[23]和煙草[24]抵御冷害逆境有關，表明佛手在逆轉座子基因功能性上與其它作物在這個方面具有一定的共性。

植物受病原物侵染時常產生一些發(fā)病相關蛋白(Pathogenesis-related Proteins，簡稱PR蛋白)進行抵御，β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)即是其中之一[25]。3-G15 98%同源于受乙烯脅迫的甜橙中分離鑒定的β-1,3-glucanase[26]，同時81%同源于受寒冷脅迫誘導的“Fortune”柑橘(克萊門氏小柑橘x酸桔)中分離鑒定的β-1,3-glucanase[27]。β-1,3-glucanase在佛手低溫脅迫后表達量明顯增加，它的增加能加速β-1,3-葡聚糖的水解[28]，水解的寡糖產物被認為是植物防御反應的重要激發(fā)子。

3.3 細胞壁代謝相關基因

佛手低溫脅迫下獲得的差異片段中，有3個片段的功能與細胞壁組分和細胞壁代謝相關，它們通過增厚細胞壁、調整細胞壁的成分，從而增加佛手對低溫的耐受能力，其對應功能是：纖維素合酶(Cellulose synthase protein)、伸展蛋白(Extensin-like protein)、葡聚糖轉葡糖苷酶(Xyloglucanendotransglycosylase,XET)。

纖維素和伸展蛋白是植物細胞壁的主要組成成分，7-6-5和7-6-33-1高度同源于擬南芥的Cellulosesynthase和Extensin-like，這2個基因在佛手低溫脅迫后表達量的都增加?？梢员徽J為是在受到低溫脅迫時，佛手通過加強細胞壁合成能力，加厚細胞壁來抵御低溫對它的傷害，同時提高其抵御寒冷的能力[29]。同時佛手的伸展蛋白基因100%同源于香櫞在病毒脅迫下獲得cDNA片段[30]，此片段在病毒脅迫后香櫞中也是上調表達，伸展蛋白的積累量與細胞經(jīng)脅迫后受到的傷害程度呈正相關[31]，這也在一定程度上證明了佛手抗寒性低在-4℃的低溫下細胞已經(jīng)受到傷害[32]。

7-3-29與擬南芥的Xyloglucanendotransglycosylase高度同源，XET能夠改變植物細胞壁主要成分，因此在形態(tài)學發(fā)生和組織形成過程中起著至關重要的作用[33]。擬南芥中存在著XET基因家族，其中TCH4能夠迅速的對低溫進行反應，通過增加TCH4的表達量調整植物細胞壁的成分、細胞大小、形狀，從而增加對低溫的抗性。

3.4 抗氧化性相關基因

細胞的抗氧化能力與植物的抗寒性呈正相關的。植物遭遇低溫脅迫或經(jīng)歷低溫鍛煉其實都是經(jīng)歷一個氧化脅迫的過程。低溫下由于植物對O2的利用能力降低，多余的O2能在代謝過程中被轉化成對植物有毒害作用的活性氧。故過剩的O2對需O2生物有潛在毒性，必須通過植物抗氧化系統(tǒng)及時清除。

8-3-10同源于過氧化物酶(POD)基因，并在佛手低溫脅迫后基因表達量增加。這說明低溫對POD有一定誘導作用，而低溫誘導產生的POD一定程度緩解了植物氧化性傷害；但隨氧化程度的加重，植物細胞受到傷害加重甚至死亡，這些抗氧化酶合成的量也將逐漸降低并最終失活。

硫氧還蛋白(Thioredoxin family protein)在維持細胞氧化還原平衡上起著重要作用[34]，8-4-29-3同源于擬南芥的thioredoxinfamily。硫氧還蛋白M1型基因AtTRX m1與生物環(huán)境脅迫有一定的相關性，尤其在逆境脅迫引起的氧化脅迫中，蛋白質中半胱氨酸殘基易被活性氧氧化，在蛋白質分子內或分子間形成較穩(wěn)定的二硫鍵(—S—S—)，這些被氧化半胱氨酸殘基能為TRX系統(tǒng)還原，從而恢復其功能，除此之外，Trx還直接或間接調控植物抗氧化保護酶系統(tǒng)的活性[35]，因此，本研究中TRX的上調表達能夠增強植物對逆境的耐受力。

3.5 其他重要功能基因

6-C22高度同源于擬南芥的ATP-binding轉運體(ABC)基因，從半定量結果來看，佛手的ABC 轉運體基因在低溫脅迫后表達量明顯上調。Moussatova等[36]認為ABC 轉運體是一種整合的膜蛋白，可以在有ATP的前提下把細胞所產生的毒素和異生素轉運出細胞外[37-38]。而從植物適應脅迫環(huán)境是一個需要 ATP的過程來推測，循環(huán)電子傳遞或葉綠體呼吸電子傳遞可能會提供額外的ATP 以適應低溫脅迫下一些耗能的反應[39-40]。低溫脅迫下ABC 轉運體的表達量增加，佛手可供給的ATP的增加，從而對低溫脅迫下的佛手起保護作用。

1-C1同源于亞精胺/腐胺轉運通透酶potB基因，在低溫脅迫后表達量增加。多胺廣泛存在于生物細胞中，是一類低分子脂肪含氮物，多胺與植物的抗逆性關系密切，包括水分脅迫、溫度脅迫和鹽脅迫。在逆境脅迫下，植物細胞內多胺含量及合成酶的活性顯著上升，所以用于轉運多胺的通透酶的量也將上升，以提高對增加的亞精胺和腐胺的轉運能力[41]。

綜上所述，佛手受低溫脅迫時有一個復雜的生理和分子調控下的抵抗機制。低溫脅迫下，有大量相關基因表達或差異表達，根據(jù)基因功能分析，其中與植物逆境應答和光合作用有關的基因的下調表達可能是造成佛手寒敏感的主要原因。要找到佛手寒敏感機制的關鍵基因及信號傳導機制還有待于更深入和廣泛的研究。

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