王 文，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

SSR又稱微衛(wèi)星（Microsatellite），為簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat），是由 1～5個(gè)核苷酸組成的首尾相連重復(fù)多次的短DNA序列[1-3]。Tautz等[4]研究發(fā)現(xiàn)，SSR在真核生物中具有普遍性和廣泛性?？梢酝ㄟ^設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測具有簡單重復(fù)序列的DNA多態(tài)性[5-6]。

黃芪為豆科黃芪屬植物，其正品黃芪為蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根。目前，市場上有一些偽黃芪，其與正品黃芪在形態(tài)、性狀及化學(xué)成分上都極為相似，所以用傳統(tǒng)的鑒別方法很難將其鑒別[7-8]。近年來，不斷發(fā)展的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[9-12]為黃芪的品種鑒定提供了新的方法。其中，SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多等位性、共顯性和對(duì)基因組有很好的覆蓋性等特點(diǎn)，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。現(xiàn)在已經(jīng)證明，SSR引物在同科不同屬的物種間甚至是不同科的物種間也可擴(kuò)增出重復(fù)序列。由于黃芪的分子生物學(xué)研究較少，已公布黃芪的EST序列只有140多條，僅能設(shè)計(jì)出少量的黃芪SSR引物。

本試驗(yàn)從大豆中篩選出30對(duì)SSR引物，與設(shè)計(jì)的引物，相輔助對(duì)黃芪進(jìn)行分子標(biāo)記，旨在成功擴(kuò)增出SSR位點(diǎn)的引物，用來鑒別黃芪的真?zhèn)巍?/p>

1 材料和方法

1.1 供試材料

2012年8月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的中草藥園中，分別采集膜莢黃芪、蒙古黃芪和華黃芪新鮮幼嫩的葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 其采用CTAB高鹽法，具體步驟為：稱取黃芪嫩葉0.2 g，用滅菌蒸餾水將其洗凈晾干后，移入預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，分裝至2.0 mLEP管中，向管中加入1.0 mL預(yù)熱的2×CTAB提取液（在水浴鍋預(yù)熱至65℃）和20μL的β-巰基乙醇，混勻，放入65℃的水浴鍋中預(yù)熱40 min，并不時(shí)輕輕搖動(dòng)；室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清至新的EP管（若有懸浮物再離心）；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提液，輕輕顛倒搖勻，室溫下12 000 r/min離心10 min，取水相至新的EP管；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提液，輕輕顛倒搖勻，室溫下12 000 r/min離心10 min，取水相至新的EP管；向EP管加入1/2體積的5 mol/L NaCl和3/4體積的異丙醇，輕輕搖勻，在-20℃冰箱靜置30 min，沉淀DNA；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，回收DNA沉淀；用70%乙醇洗滌沉淀2次，自然干燥；將DNA溶于 50μL滅菌TE中，加入 0.5μL（100μg/mL）RNaseA，輕輕搖勻，37℃溫浴1 h，短期內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA完整性和純度的鑒定

1.2.2.1 DNA完整性的鑒定 取5μL溶解的DNA，加入2μL溴酚藍(lán)試劑和1%的瓊脂糖凝膠，采用DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，在120 V電壓下電泳30 min，電泳緩沖液是pH值為8的0.5×TBE。在凝膠電泳圖像分析儀上進(jìn)行拍照分析，結(jié)果如圖1所示。

1.2.2.2 DNA純度的鑒定 用雙蒸水稀釋40倍（取5μL樣加入200μL的雙蒸水）至每毫升含5～50μg DNA范圍，同時(shí)以雙蒸水作空白對(duì)照。于核酸蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測儀下測出A260/A280的值，每樣品重復(fù)2次。

1.2.3 引物的篩選與設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)借用同科植物大豆的30對(duì)SSR引物，同時(shí)根據(jù)NCBI中已經(jīng)公布的140多條EST序列，使用DNASTAR.Lasergene.v 7.1，SSRHunter 1.3，premier 3.0嘗試著設(shè)計(jì)引物，并根據(jù)引物設(shè)計(jì)的最適原則選取了最優(yōu)的1對(duì)SSR引物[13-15]。

1.2.4 引物的PCR擴(kuò)增 通過對(duì)蒙古黃芪、膜莢黃芪和華黃芪的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選可以擴(kuò)增出具有明顯多態(tài)性的引物。部分引物序列如表1所示。擴(kuò)增的條件經(jīng)過梯度PCR儀器優(yōu)化后為：預(yù)變性 94℃ 3 min；94℃ 40 s，Tm（退火溫度）30 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min；4℃10 min。

表1 具有多態(tài)性的引物

1.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳

對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用銀染法進(jìn)行顯色，最后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的選擇

本試驗(yàn)采用CTAB高鹽法提取黃芪新鮮幼葉中的DNA，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，提取的黃芪DNA其純度的比值均在1.80～2.00之間，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1 659.32～1 990.28μg/g之間，無RAN和蛋白的干擾。說明CTAB高鹽法適合于提取黃芪基因組DNA。

表2 所測樣品的DNA純度和質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 引物的擴(kuò)增結(jié)果

從試驗(yàn)結(jié)果可以得出，選取大豆的30對(duì)SSR引物中有6對(duì)在黃芪擴(kuò)增中出現(xiàn)了SSR等位基因（圖 2），其編號(hào)分別為 598，168，406，315，322，215，并且根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)的1對(duì)SSR引物（其編號(hào)暫定為1a1b）也同樣擴(kuò)增出了等位基因。從成功擴(kuò)增出等位基因的這7對(duì)引物中可明顯看出，不同物種中每對(duì)引物擴(kuò)增出的SSR等位基因的數(shù)目、大小幾乎都有一定的差異。說明不同物種中不同的SSR位點(diǎn)，其側(cè)翼序列或重復(fù)序列本身具有差異性及具有不同程度上的保守性。

這7種引物在蒙古黃芪、膜莢黃芪和華黃芪中，擴(kuò)增出的SSR等位基因數(shù)如表3所示。從圖2還可以看出，這3種材料很多位點(diǎn)的條帶都很接近，差別甚至只有幾個(gè)bp到十幾個(gè)bp，這可能是由SSR重復(fù)次數(shù)的微小差異造成的，表明了SSR位點(diǎn)的多態(tài)性。

表3 引物在各物種中擴(kuò)增的SSR等位基因的數(shù)目

3 結(jié)論

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，用CTAB高鹽法提取黃芪幼葉的DNA，可以得到完整的具有較好純度和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DNA。在對(duì)材料基因組信息沒有太多了解的基礎(chǔ)上，借用同科植物的SSR引物和根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)SSR引物，可以避免構(gòu)建DNA文庫的麻煩，節(jié)省開支，方法有效可行。本試驗(yàn)所篩選和設(shè)計(jì)的SSR引物可以用來鑒別黃芪的真?zhèn)巍?/p>

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