李 銳 ，白建榮 ，張叢卓 ，賈志寬

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

玉米是高產(chǎn)且有多種用途的重要作物，是山西省種植面積最大及總產(chǎn)量最高的農(nóng)作物。山西省地形復(fù)雜，南北跨越6.3個緯度，境內(nèi)山巒起伏，海拔相差1 800 m左右，氣候變化多樣，生態(tài)類型復(fù)雜，玉米種植區(qū)分為春播特早熟區(qū)、春播早熟區(qū)、春播中晚熟區(qū)、夏播中早熟區(qū)等4個大區(qū)。其中，春播中晚熟玉米區(qū)[1]包括大同、忻州、晉中、陽泉、呂梁、太原、長治、臨汾、晉城9個市60個縣的632個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，是山西省玉米種植范圍最廣、面積最大、產(chǎn)量占全省玉米總產(chǎn)量1/2左右的重要生產(chǎn)區(qū)。

因此，深入分析該區(qū)優(yōu)良自交系及其在雜種優(yōu)勢利用方面的規(guī)律，對玉米種質(zhì)的改良、創(chuàng)新、擴(kuò)增和提高育種效率具有重要的意義。國內(nèi)外多項(xiàng)研究已經(jīng)證明[2-13]，利用SSR分子標(biāo)記劃分雜種優(yōu)勢群高效而且準(zhǔn)確，與系統(tǒng)分析基本保持一致。

本研究利用覆蓋玉米全基因組的40個SSR標(biāo)記，對山西省中晚熟玉米區(qū)近年來主要應(yīng)用的玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，以便為今后玉米品種的選育、種質(zhì)利用、種質(zhì)改良、擴(kuò)增提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料分為2大部分：（1）6份標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種用于未知材料的類群劃分，包括黃早4，丹340，Mo17，B73，掖 478和齊 319，分別代表唐四平頭群、旅大紅骨群、蘭卡斯特群（Lancaster）、Reid群、PA群和PB群；（2）近年來山西省中晚熟區(qū)玉米18個審定品種的32份親本自交系（表1）。

表1 山西省中晚熟區(qū)玉米審定品種的親本自交系

1.2 DNA的提取

分別取不同材料15粒種子，浸種12 h，25～30℃暗培養(yǎng)7 d，取黃化嫩葉，采用CTAB法[14]單株提取并純化葉片基因組DNA。采用eppendorf公司的蛋白核酸定量測定儀測量DNA的質(zhì)量濃度，把DNA調(diào)至20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物選擇

引物按照擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、在染色體上均勻分布的原則篩選出來（表2）。

1.4 SSR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad公司的PTC200 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積為20μL，其中，1×PCR Buffer（Mg2+），125μmol/L dNTP，0.5μmol/L SSR引物，Taq DNA聚合酶 0.5 U，DNA模板80 ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性7 min，1個循環(huán)；94℃變性40 s，50～65℃（視引物而定）退火35 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

用6%聚丙酰胺變性凝膠電泳分離SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，在60 W恒功率下，電泳1 h左右，卸下凝膠，用單蒸水清洗1次，用0.3%的硝酸銀溶液染色15 min左右，再用單蒸水清洗后放入2%氫氧化鈉加0.5%甲醛溶液中顯影到條帶清晰，單蒸水清洗后自然晾干。在白熾燈下觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和掃描照相。

表2 40對SSR引物信息

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SSR擴(kuò)增電泳圖，構(gòu)建0-1數(shù)據(jù)庫（在相同遷移位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”）。（1）按 Nei和 Li的方法計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離（遺傳相似系數(shù)GGS＝2Nij/（Ni＋Nj）；遺傳距離GGD＝1－GGS。其中，Ni為i品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)；Nj為j品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)。）（2）按Smith等[15]提出的方法，計算多態(tài)性信息量（Polymorphisminformation content，PIC）、標(biāo)記索引系數(shù)（Marker Index，MI）和等位基因有效系數(shù)（Effective number of alleles，NE），PPIC＝1－∑fi2；MMI＝等位基因數(shù)×PPIC；NNE＝1/∑fi2。（3）利用 GD值按不加權(quán)成對群算術(shù)平均法（Unweighted pair group method rithmetic averages，UPGMA） 進(jìn)行聚類分析。（4）進(jìn)行特有基因和稀有基因的統(tǒng)計（特有基因是指在標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)中沒有且只有1個供試自交系有的等位基因；稀有基因是指在標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)中沒有且2個以上供試自交系有的等位基因）。所有數(shù)據(jù)處理均由 NTSYSpc Version 2.10e和Excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分析

本研究利用40對SSR引物對6個國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測種和32份玉米自交系進(jìn)行同源位點(diǎn)的擴(kuò)增。

從表2可以看出，山西省中晚熟玉米種植區(qū)自交系的遺傳多樣性非常豐富，本研究所選用覆蓋玉米全基因組的40對SSR引物，共檢測到210個等位基因，每對引物檢測出的等位基因數(shù)為2～11個，平均每個位點(diǎn)5.25個。PIC變化范圍為0.41～0.84，平均為0.67；MI變化范圍為0.82～5.14，平均為2.49；NE變化范圍為1.70～6.39，平均為3.42。在24個位點(diǎn)共檢測出35個稀有等位基因，其中，在bnlg2331位點(diǎn)檢測到稀有等位基因數(shù)最高（4個）。有19個位點(diǎn)有特有等位基因，共檢測出31個特有等位基因，其中，mmc0191和phi126這2個位點(diǎn)，檢測到特有等位基因數(shù)目高達(dá)4個。反映了中晚熟玉米種植區(qū)自交系豐富的遺傳多樣性。引物bnlg2331獲得的等位基因數(shù)最多（11個），PIC值（0.84）和NE值（6.39）也最高，而umc1279獲得的等位基因數(shù)最低（2個），PIC值（0.41）和 NE值（1.70）也最低，說明等位基因的多少與PIC值和NE值存在一定的相關(guān)性。而MI值與等位基因的數(shù)目的相關(guān)性不明顯，如bnlg1496位點(diǎn)雖然只擴(kuò)增出7個等位基因，而 MI值卻最高（5.14）；umc1279擴(kuò)增的等位基因最少（2個），MI值也最低（0.82）。

2.2 供試自交系中檢測到的稀有等位基因和特有等位基因

從表3可以看出，每個自交系都有數(shù)目不等的稀有等位基因，其中，運(yùn)98-2-19有9個，太411有8個，S982，S981和GS1502均有7個。15個自交系有特有等位基因，其中，148和P83均有4個。

表3 32份自交系中檢測到的稀有等位基因和特有等位基因

2.3 聚類分析

以SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)建立矩陣，利用NTSYSpc Version 2.10e數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行UPGMA聚類分析，建立樹狀聚類圖（圖1）。在GS約為0.74時，32份自交系很明顯被分為4大群（表4）。第Ⅰ類群分為3個亞群，第1亞群（BSSS種質(zhì)）只有標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)B73而無試驗(yàn)材料；第2亞群（PA種質(zhì)） 包括掖 478，E330，GS141，191，太113，478，G694；第 3亞群（蘭卡斯特種質(zhì)）包括Mo17，S981，G 688。第Ⅱ類群（旅大紅骨種質(zhì)）包括丹 340，P01，Q1261，K12-2，X012，GS1502，148，933，太 411，太 96-1，黃金 96C，運(yùn) XL紅，P 83，海9-21。第Ⅲ類群（PB種質(zhì)）包括齊319，D1815，P037，X901，運(yùn) 98-2-19，L3115，931，S89。第Ⅳ類群（唐四平頭種質(zhì)）包括黃早4，S982，L0367，31-6，D12。

表4 32份玉米自交系UPGMA聚類結(jié)果

3 討論

PIC值被認(rèn)為是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)，當(dāng)某DNA標(biāo)記位點(diǎn)PIC＞0.5時,表明其為高度多態(tài)位點(diǎn)；DNA標(biāo)記位點(diǎn)的平均PIC可被用來估算群體的遺傳多樣性水平，群體的平均PIC值越高，表明群體的DNA標(biāo)記位點(diǎn)變異程度越高，群體的遺傳多樣性越豐富。本研究選用的SSR引物位點(diǎn)的平均PIC為0.67，只有2個位點(diǎn)的PIC小于0.5。稀有等位基因和特有等位基因的數(shù)目也可從另一方面反映供試群體遺傳多樣性的程度即異質(zhì)性，每一自交系都有數(shù)量不等的稀有等位基因，最高的可達(dá)9個。15個自交系有特有等位基因，其中，148和983均有4個。表明用于培育山西中晚熟玉米區(qū)玉米雜交品種自交系的遺傳多樣性非常豐富，很多自交系可能具有獨(dú)特的基因。

本研究表明，近年來在山西中晚熟玉米種植區(qū)推廣的玉米品種，主要利用PA，PB，旅大紅骨雜種優(yōu)勢群，占本研究全部材料的71.8%；而蘭卡斯特、唐四平頭種質(zhì)利用較少，沒有一個親本屬于Reid群。在18個審定品種中，14個使用旅大紅骨雜種優(yōu)勢群作親本，說明該雜種優(yōu)勢群使用的頻率非常高。6個審定品種大豐2號（Q1261×D1815）、大豐 5號（K12-2×D1815）、晉玉 811（X012×X901）、晉玉 168（P037×P01）、強(qiáng)盛28號（933×931）和晉單55號（運(yùn) XL紅×運(yùn)98-2-19）為旅大紅骨×PB雜優(yōu)模式（33.3%），是春播中晚熟區(qū)的主要雜優(yōu)模式。

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