王鵬軍 孫明謙 苗 陽(yáng) 劉玲玲

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，天津，300193;2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心，北京，100091)

中醫(yī)證候具有明顯的整體性，每個(gè)證候涉及多個(gè)器官或多個(gè)系統(tǒng)的病理改變，因此必然涉及多層次和多方面的物質(zhì)基礎(chǔ)。而某種客觀指標(biāo)具有明顯的專(zhuān)一性與客觀性，體現(xiàn)不出證的整體性和系統(tǒng)性，不能反應(yīng)中醫(yī)證候的本質(zhì)［1］。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)研究中一種重要的技術(shù)手段，與中醫(yī)辨證方法有一個(gè)共同點(diǎn)―強(qiáng)調(diào)整體觀，即挖掘機(jī)體內(nèi)在的整體代謝規(guī)律，故可以把代謝組的理論、方法和技術(shù)作為研究中醫(yī)證本質(zhì)的出發(fā)點(diǎn)和切入點(diǎn)［2］。本研究以缺血性心力衰竭氣虛血瘀證和陽(yáng)虛水停證為研究對(duì)象，研究?jī)勺C型的代謝組學(xué)特征，比較兩證型代謝模式及代謝物質(zhì)群的差異，探索代謝組學(xué)在研究缺血性心力衰竭中醫(yī)證候中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例來(lái)源于2011年10月至2012年12月因缺血性心力衰竭于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管科住院的患者，所有患者經(jīng)3名主治以上中醫(yī)師辨證為氣虛血瘀證和陽(yáng)虛水停證。本試驗(yàn)共收集病例36例，其中氣虛血瘀證18例，陽(yáng)虛水停證18例。兩組患者在年齡、性別、合并疾病等方面沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，P ＞0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1.1 心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照美國(guó)心力衰竭協(xié)會(huì)2010年《心力衰竭治療指南》［3］、中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2010年《急性心力衰竭診斷與治療指南》［4］及2007 年《慢性心力衰竭診斷與治療指南》［5］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.1.2 心功能判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1928年NYHA心功能分級(jí)方案，分為4級(jí)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2.1.3 心力衰竭分期(分階段)標(biāo)準(zhǔn) 采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2007年《慢性心力衰竭診斷與治療指南》［5］，將心力衰竭分為四個(gè)階段。

1.2.1.4 冠心病診斷依據(jù) 參照ACCF/AHA2011年《不穩(wěn)定性心絞痛/非ST段抬高性心肌梗死患者管理指南》［6］、歐洲心臟病學(xué)會(huì)2011《非ST段抬高性急性冠脈綜合征處理指南》［7］及中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2010年《急性ST段抬高性心肌梗死診斷治療指南》［8］制定。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002.5試行)［9］證候診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)年齡40～85歲的缺血性心力衰竭患者;2)心力衰竭的基礎(chǔ)病因是冠心病或合并高血壓;3)LVEF≤50%;4)NYHA心功能分級(jí)為Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)(心力衰竭分期為C期或D期);5)中醫(yī)辨證為氣虛血瘀證和陽(yáng)虛水停證;6)簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)急性冠脈綜合征、肺栓塞和急性腦血管病;2)其他心臟病:瓣膜心臟病、擴(kuò)心病、高心病、肺心病和先心病;3)糖尿病、肝功能不全者(ALT、AST升高超過(guò)正常值的3倍)、腎功能不全(血肌酐超過(guò)3mg/dL);4)惡性腫瘤終末階段惡病質(zhì)狀態(tài)患者;5)拒絕接受此項(xiàng)研究或近1個(gè)月參加其他研究的患者。

1.5 試劑與材料 乙腈為色譜純購(gòu)于美國(guó)Fisher公司;甲酸為色譜純購(gòu)于J.T.BAKER公司;純凈水購(gòu)于中國(guó)娃哈哈有限公司;次黃嘌呤、肌酐、尿酸購(gòu)于sigma公司。

1.6 樣本的采集與保存 受試者入組后次日早餐前抽取肘經(jīng)脈血約5mL，置于真空采血管(EDTA－K3抗凝管)中，采集樣品經(jīng)4℃，3000 r/min中離心10min后取上清血漿，置于－80℃保存。

1.7 樣品處理 血漿樣品在室溫下溶化后，取50 μL血漿加入200 μL乙腈溶劑沉淀震蕩后在室溫下靜止10min，經(jīng) 12000 r/min，4℃ 離心 10 min 后，取 200 μL上清，過(guò)0.22um濾膜后，進(jìn)入LC－MS分析。

1.8 色譜條件 液相色譜為美國(guó)Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)，液相分離分別采用BEH C18色譜柱(X－bridge，2.5 μm，2.1mm ×100mm，waters，IELAND)流動(dòng)相采用0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)梯度如下:35%B;3min，60%B;15min，75%B;18min，95%B;20min，95%B;22min，35%B;28min，stop;2min，平衡，流速為0.25mL/min，柱溫35℃。

1.9 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用美國(guó)Agilent 6520 series Time of Flight mass spectrometer equipped with an electro－spray ionization(ESI)Interface(LC－TOF－MS)。霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，碰撞氣為氦氣。采集模式為正離子，毛細(xì)管電壓為3500eV，霧化溫度為350℃，干燥氣為10.0L/min，霧化氣為30 psi。質(zhì)譜掃描范圍為m/z 80–1000，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存模式為centroid。離子源采用雙ESI噴霧，質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過(guò)兩個(gè)已知的標(biāo)準(zhǔn)品［Hexakis(1H，1H，3H －tetrafluoropropoxy)phosphazine和7H－purine，對(duì)應(yīng)m/z 922.00980和121.0509］進(jìn)行實(shí)時(shí)矯正。參比液通過(guò)Angilent isocratic泵以0.01 mL/min的速度噴入質(zhì)譜。

1.10 數(shù)據(jù)處理方法 LC－MS所采集數(shù)據(jù)通過(guò)Agilent Mass Hunter(version－2.0)和Mass Professor profiler(MPP)軟件進(jìn)行系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析。首先LC－MS數(shù)據(jù)通過(guò)Agilent Mass Hunter(version－2.0)工作站中的Molecular Feature extraction(MFE)功能對(duì)每個(gè)樣本中的分子進(jìn)行提取并創(chuàng)建mass features用于以后分析。在MFE分析中m/z的豐度數(shù)值大于500的數(shù)據(jù)才會(huì)被采集納入mass features的計(jì)算中。豐度的計(jì)算是由Mass Hunter軟件對(duì)一個(gè)分子相應(yīng)的isotopic和adductive peaks豐度加合后產(chǎn)生。最后，在所采集的mass features中，豐度大于3000的features被納入和整理成數(shù)據(jù)以待進(jìn)一步分析。

通過(guò)Mass Hunter軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步輸入到Mass profiler professor(MPP)軟件中進(jìn)行分析。MPP分別采用排列、歸一化、修正80%規(guī)則、數(shù)據(jù)集分割和數(shù)據(jù)縮放等方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理，所得數(shù)據(jù)最后應(yīng)用SIMICAP+統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行進(jìn)一步的PCA和PLSDA的分析。

2 結(jié)果

2.1 LC－MS的代謝輪廓圖 本實(shí)驗(yàn)采用HPLCTOF－MS技術(shù)分別對(duì)缺血性心力衰竭不同證候患者血清中的成分進(jìn)行代謝組學(xué)分析。Typical base ion currents(TIC)如圖1所示。

2.2 多元數(shù)據(jù)分析

2.2.1 缺血性心力衰竭氣虛血瘀證和陽(yáng)虛水停證的OPLS－DA數(shù)據(jù)分析 如圖2所示，陽(yáng)虛水停證組與氣虛血瘀組在OPLS－DA模式識(shí)別中呈現(xiàn)了明顯的區(qū)別。說(shuō)明兩種中醫(yī)證候的心力衰竭患者體內(nèi)代謝成分呈現(xiàn)出了一定的差別。

圖1 Typical serum total ion current(TIC)performed on HPLC－MS A:Serum TIC of Qixu group B:Serum TIC of Yangxu group

圖2 PLS－DA(A:R2Y=0.992，Q2=0.637)and OPLS－DA(B:R2Y=0.992，Q2=0.287)score plots of Yangxu and Qixu groups.Red:Qixu group Blue:Yangxu group

2.2.2 缺血性心力衰竭氣虛血瘀證和陽(yáng)虛水停證的差異性代謝物質(zhì) 在PLS－DA分析中VIP數(shù)值大于1，一般被認(rèn)為是對(duì)模式區(qū)分有貢獻(xiàn)的主要成分。因此，認(rèn)為這些小分子成分在正常組和疾病組之間的區(qū)別較大，在模式識(shí)別中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)將VIP大于1的組分作為潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的分析。內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)篩查首先是通過(guò)MPP軟件，將LC－MS數(shù)據(jù)中每個(gè)被是分子的代謝產(chǎn)物視為一個(gè)features進(jìn)行數(shù)據(jù)提取。feature的精確分子量，同位素豐度，輸入到METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。通過(guò) student t－ test(Unilateral，Equal Variances)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，P值小于0.05的潛在生物標(biāo)志物，通過(guò)進(jìn)一步的MS/MS實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。將這些潛在生物標(biāo)志物的碎裂方式進(jìn)行分析與比對(duì)，從而驗(yàn)證這些標(biāo)志物的結(jié)果推斷。最后，通過(guò)對(duì)一些標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)最終確定生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)。

如表2所示，得到9種缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證和氣虛血瘀證的差異性代謝物質(zhì)，將各差異性代謝物質(zhì)與整體代謝網(wǎng)絡(luò)途徑相匹配后，確認(rèn)了其所在的代謝生化通道及在各組間變化方向。

表2 缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證與氣虛血瘀證生物標(biāo)志物比較及代謝通路

3 討論

3.1 能量代謝 本研究顯示，缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證較氣虛血瘀證，參與能量代謝的肉堿類(lèi)物質(zhì)(Dodecanoyl carnitine、cis－5－Tetradecenoyl carnitine和Palmitoyl carnitine)、脂肪酸(4，8 －dimethyl－dodecanoic acid和3，9，15 －Docosatriynoic acid)以及肌酐(Creatinine)含量升高，表明兩證型在能量代謝方面存在差異。

心肌正常的能量代謝主要包括三個(gè)過(guò)程。1)代謝底物的利用。2)氧化磷酸化——通過(guò)線(xiàn)粒體呼吸鏈產(chǎn)生能量。3)ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用——ATP轉(zhuǎn)運(yùn)至心肌纖維以供應(yīng)心臟泵血所需要的能量。線(xiàn)粒體肌酸激酶將ATP的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給肌酸形成磷酸肌酸和ADP，磷酸肌酸從線(xiàn)粒體擴(kuò)散至心肌纖維后，由心肌纖維內(nèi)肌酸激酶將其高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP形成ATP。磷酸肌酸脫掉高能磷酸鍵以后形成的游離的肌酸很快又?jǐn)U散至線(xiàn)粒體內(nèi)［10－12］。此外，心肌還可以利用酮體等合成能量。

中醫(yī)認(rèn)為，氣虛為陽(yáng)虛之漸，陽(yáng)虛為氣虛之甚，陽(yáng)虛患者更易疲勞，活動(dòng)耐量明顯減低。氣虛血瘀證多見(jiàn)于缺血性心力衰竭的早期，陽(yáng)虛水停證多見(jiàn)于缺血性心力衰竭的晚期。隨著心力衰竭的發(fā)展，心力衰竭晚期脂肪酸代謝異常，氧化減少，心肌ATP合成減少;肌酸激酶活性降低，高能磷酸鹽生成不足，心肌能量利用障礙［13－14］。缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證肉堿類(lèi)及脂肪酸類(lèi)較氣虛血瘀證含量升高，可能由于肉堿－脂酰肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制異常，脂肪酸以及肉堿不能進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)而在胞漿聚集，導(dǎo)致ATP合成減少。肌酐為肌酸的代謝產(chǎn)物，缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證肌酐較氣虛血瘀證含量升高，可能由于肌酸激酶活性減低，肌酸不能有效合成磷酸肌酸而在體內(nèi)聚集，分解代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致其含量升高，心肌能量利用障礙。本研究顯示，缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證較氣虛血瘀證，能量合成不足，能量利用障礙，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

3.2 磷脂代謝 本研究顯示，缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證較氣虛血瘀證，參與磷脂代謝的Linolenoyl lysolecithin、1－h(huán)exadecyl－2－acetyl－glycero－3－Phosphocholine以及1－Linoleoyl phosphatidyl choline含量降低，表明兩證型在磷脂代謝方面存在差異。

溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine，LPC)是氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL)的主要活性成分。研究顯示，LPC在動(dòng)脈粥樣硬化中是一個(gè)關(guān)鍵的致炎因子。LPC可以增加培養(yǎng)的人和兔動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的血管細(xì)胞黏附分子－1(Vascular cell adhesion molecule－1，VCAM)和細(xì)胞間黏附分子－1(Intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)的表達(dá)，促進(jìn)單核和單核樣細(xì)胞的趨化黏附，而黏附在內(nèi)膜上的單核細(xì)胞又可以啟動(dòng)血管壁中強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，加重脂蛋白的氧化，而氧化的脂蛋白可以進(jìn)一步損害內(nèi)膜，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)的惡性循環(huán)。LPC還可以以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL－8和單核細(xì)胞趨化蛋白－1(Monocyte chemoattractant protein，MCP－1)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL－1β等介導(dǎo)斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)［15－16］。李偉軍［17］等的研究顯示，LPC還能夠明顯增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL－6、TNF－α mRNA的表達(dá)及上清液中的含量。LPC可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮其促炎性作用，如與細(xì)胞膜的特定受體相結(jié)合、通過(guò)非受體途徑直接與細(xì)胞膜結(jié)合等［18］。

中醫(yī)認(rèn)為，氣虛為陽(yáng)虛之漸，陽(yáng)虛為氣虛之甚。氣虛血瘀證多見(jiàn)于缺血性心力衰竭的初期，而陽(yáng)虛水停證多見(jiàn)于缺血性心力衰竭的晚期?，F(xiàn)已證實(shí)，心力衰竭與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，隨著心力衰竭的發(fā)展及惡化，炎性因子釋放增多，炎性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)［19］。

本研究顯示，缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證較氣虛血瘀證，與炎癥反應(yīng)有關(guān)的溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)Linolenoyllysolecithin、1－h(huán)exadecyl－2－acetyl－glycero－3－Phosphocholine和1－Linoleoyl phosphatidylcholine含量降低，表明缺血性心力衰竭陽(yáng)虛水停證較氣虛血瘀證，溶血磷脂酰膽堿介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有進(jìn)一步的紊亂，其機(jī)制有待更加深入的研究。

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