王悅

人全血培養(yǎng)方法篩選抗類風濕性關節(jié)炎青藤堿衍生物

王悅

目的 通過人全血培養(yǎng)方法篩選有潛在抗類風濕性關節(jié)炎作用的青藤堿衍生物。方法 細菌酯多糖(LPS)刺激人全血誘導TNF-α產(chǎn)生, 加入青藤堿衍生物, ELISA法檢測其對TNF-α生成的抑制作用。結果 濃度為10～4 mol/L 時, 青藤堿衍生物SIN-3、SIN-33對TNF-α的抑制率分別為22.9%和31.1%, 其中SIN-33的抑制作用明顯比強于青藤堿(24.2%)， P＜0.05。結論 青藤堿衍生物SIN-33可明顯抑制人全血中LPS誘導的TNF-α的生成, 可作為抗類風濕性關節(jié)炎候選藥物進一步研究。

類風濕性關節(jié)炎；青藤堿；人全血培養(yǎng)；TNF-α

類風濕性關節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病, 目前通常采用非甾體類抗炎藥對癥治療以及各種抗風濕藥物對疾病進行調(diào)節(jié)。因此, 臨床上急需可同時調(diào)節(jié)類風濕性關節(jié)炎癥狀和進程的小分子藥物。

青藤堿(sinomenine, SIN)是從中藥青藤中提取的, 可抑制或治療炎癥、免疫反應和類風濕性關節(jié)炎。研究顯示青藤堿可降低體內(nèi)炎癥細胞因子的mRNA表達［1］。本研究中根據(jù)文獻對青藤堿C環(huán)和D環(huán)進行了修飾得到兩個化合物(圖1), 然后通過人全血方法檢測對LPS刺激人全血后產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)的抑制作用, 并與青藤堿進行比較。

圖1 青藤堿衍生物的化學結構

① 實驗材料

青藤堿衍生物SIN-3和SIN-33(上海睿智化學研究有限公司合成)；青藤堿(＞99%, 陜西華昌生物工程公司)；LPS (Sigma公司)；人腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D 公司)。

② 實驗方法

從7名健康志愿者末梢靜脈抽取100 μl外周血注入含EDTA無內(nèi)毒素的采血管中, 放置1 h, 用 900 μl 的 RPMI 1640 (含10% 胎牛血清)對其進行稀釋。把1μl SIN-3、SIN-33和SIN(10～4 mol/l)的二甲基亞砜溶液放入二十四孔板中, 每個樣品重復雙孔, 于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)15 min。然后除對照組外, 采用10 μl LPS(1 μg/ml)同樣在37 ℃, 5% CO2下孵育6 h, 最后把培養(yǎng)板在冰浴上以終止反應。培養(yǎng)板在4℃以1500 rpm離心10 min, 吸取上清液, 采用人酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒來檢測其中TNF-α含量, 計算各孔TNF-α含量變化的百分數(shù)。數(shù)據(jù)用(±s)E表示, 采用SPSS16.0軟件單因素方差分析進行組間比較, P＜0.05時具有顯著性差異。

3 結果

LPS刺激后, 人全血釋放TNF-α的濃度為1868 pg/ml,而對照孔中TNF-α含量接近于零。如圖2顯示, 當濃度為10～4mol/L 時, SIN-3和SIN-33均可抑制TNF-α產(chǎn)生, 抑制率分別為22.9%和31.1%, 其中SIN-33明顯比SIN 24.2%高(P＜0.05)。

圖2 青藤堿衍生物在人全血中對TNF-α的抑制率(n=7)與SIN組比較,aP＜0.05

4 討論

本研究中我們通過人全血方法比較青藤堿衍生物和青藤堿對LPS刺激產(chǎn)生TNF-α的抑制作用。LPS 是革蘭氏陰性菌的主要成分, 常用于單核細胞等細胞分泌細胞因子的強力刺激物質(zhì)［1］, 此方法目前為世界上公認的評價抗類風濕性關節(jié)炎新藥的金標準。

TNF-α 是LPS刺激后產(chǎn)生最多的介導因子, 是抗關節(jié)炎病理過程的重要因子。有研究顯示青藤堿減少TNF-α可能是其產(chǎn)生抗炎癥作用的主要機制［2］。

本研究數(shù)據(jù)顯示SIN-33在人全血中可誘導TNF-α的分泌, 說明它可成為新的抗類風濕性關節(jié)炎新藥的候選藥物,其抗關節(jié)炎作用可能也是由于抑制炎癥因子如TNF-α的表達所引起。

［1］ Franchimont D, Louis E, Dewe W, et al. Effects of dexamethasone on the profile of cytokine secretion in human whole blood cell cultures. Regulatory Peptides. 1998(73): 59-65.

［2］ Zhou H, Wong YF, Wang J, et al. Sinomenine ameliorates arthritis via MMPs, TIMPs and cytokines in rats. Biochemical and Biophysical research communications, 2008(376): 352-357.

210029 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院