韓 敏 李錦平 石 靜 李衛(wèi)萍 武 莉 王明亮 宋彬妤

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院藥理教研室，山西汾陽 032200；3.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖教研室，山西汾陽 032200；4.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心，山西汾陽 032200

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，其發(fā)生發(fā)展有多種病理生理過程的參與，其中，炎癥反應(yīng)正引起人們的廣泛關(guān)注。穿心蓮屬爵床科植物，其化學(xué)成分主要為內(nèi)酯類和黃酮類，有清熱解毒、涼血消腫等功效。內(nèi)酯化合物主要含于穿心蓮葉中，主要成分有：穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide）、新穿心蓮內(nèi)酯（neoandrographolide）、去氧穿心蓮內(nèi)酯（deoxyandrographolide）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（dehydroandrographolide）[1]。穿心蓮具有解熱抗炎、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗生育、降血糖、防治心血管病等藥理作用[2]。14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮內(nèi)酯的一種成分，屬于脫水穿心蓮內(nèi)酯。有研究表明，穿心蓮水煮液有降血糖的作用[3]。為進(jìn)一步了解穿心蓮的降血糖的有效成分及可能機(jī)制，本研究通過鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病大鼠模型，觀察14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠血糖、胰島組織形態(tài)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，以探討 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯抗炎作用與降血糖和胰島保護(hù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性 SD 大鼠 52 只，體重（220 ±20）g，清潔級，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑藥品與儀器

鏈脲佐菌素，購自美國Sigma公司；14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯-3，19-二琥珀酸半酯鉀鈉鹽，購于哈醫(yī)集團(tuán)三精加濱藥業(yè)有限公司（批號：201102081）；TNF-α一抗，購于武漢博士德生物工程有限公司（編號BA0131）；SV-0002 兩步法免疫組化檢測試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司（編號：AR1022）；三諾安穩(wěn)血糖儀和試紙條，購自長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型的制備 將52只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。禁食12 h 測空腹血糖，選擇空腹血糖正常的大鼠50只，將其中10只作為正常對照組，其余40只大鼠均一次性腹腔注射1%STZ 55 mg/kg（pH=4.5，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用），5 d后斷尾取血測空腹血糖。血糖值＞16.7 mmol/L 者為DM模型成立[4]。正常組給予1～2 mL 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.3.2 分組與用藥 選取成模大鼠36只，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、低劑量組，每組12只。成模后第2天，低劑量組給予14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯 100 mg/（kg·d），高劑量組給予 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯 200 mg/（kg·d），正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，每天5～6 mL 腹腔注射，連續(xù)給藥14 d。于給藥結(jié)束后禁食12 h，斷尾取血測血糖，麻醉后取胰腺，用4%多聚甲醛固定24 h后制成蠟塊標(biāo)本，用于做免疫組化、蘇木精和伊紅（HE）染色。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血糖測定 斷尾采血，采用血糖儀測血糖。

1.4.2 胰腺組織HE 染色 將胰腺組織的蠟塊標(biāo)本切成4 μm厚的切片，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。鏡下觀察胰島形態(tài)。

1.4.3 胰腺TNF-α免疫組化 將胰腺組織的蠟塊標(biāo)本切成4 μm 厚的切片，切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫（H2O2）封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗滌，抗原修復(fù)，封閉后依次加入TNF-α抗體、二抗孵育（用磷酸鹽緩沖液PBS 代替一抗作陰性對照），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水終止，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠血糖的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖水平與正常組比較明顯升高（P＜0.05）；給藥14 d后，高劑量組和低劑量組大鼠血糖水平與模型組比較明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠血糖的影響（mmol/L，±s）

表1 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠血糖的影響（mmol/L，±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，＊P＜0.05

組別 只數(shù) 血糖水平正常組模型組低劑量組高劑量組10 10 10 10 5.1 ±0.2 24.8±2.7#13.9 ±1.3＊9.6 ±2.5＊

2.2 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響

正常組大鼠鏡下可見胰島豐富，呈圓形或類圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核居中。模型組大鼠胰島數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核偏心分布，有的有空泡變形的現(xiàn)象。高、低劑量組大鼠胰腺組織較模型組有明顯改善，胰島數(shù)目增多，形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)增多。見圖1。

圖1 大鼠胰腺組織HE 染色（×400）

2.3 14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果的判定：TNF-α主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。正常組大鼠胰島內(nèi)TNF-α陽性細(xì)胞少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒少，呈淡棕黃色，TNF-α幾乎不表達(dá)；模型組大鼠TNF-α陽性細(xì)胞多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)深棕色顆粒多，表達(dá)呈強(qiáng)陽性；高劑量組與模型組比較，TNF-α陽性細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒減少，表達(dá)呈弱陽性；低劑量組與模型組比較，TNF-α陽性細(xì)胞減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒減少，表達(dá)呈陽性。見圖2。

3 討論

圖2 大鼠胰腺組織TNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果（×400）

胰島β細(xì)胞是胰島素合成、分泌的主要場所。因此，胰島β細(xì)胞受損是1、2型糖尿病共同的病理變化[5]，而胰島β細(xì)胞破壞的主要形式是凋亡。糖尿病時(shí)，對胰島β細(xì)胞具有損傷作用的Th1型細(xì)胞及其細(xì)胞因子與具有保護(hù)功能的Th2型細(xì)胞及其細(xì)胞因子功能失衡。Th1型細(xì)胞因子主要指TNF-α、干擾素IFN-γ等分泌增多，其中，TNF-α具有廣泛的生物活性，是最早啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的因子之一，可影響糖脂代謝，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，直接或間接造成胰島β細(xì)胞損傷，經(jīng)多種途徑影響DM的發(fā)生、發(fā)展。而DM的高滲狀態(tài)又可引起TNF-α升高，高水平TNF-α又促進(jìn)胰島β細(xì)胞損傷，形成惡性循環(huán)，不斷加重病情。TNF-α可通過與胰島β細(xì)胞上的腫瘤壞死因子受體（TNFR1）結(jié)合，觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)直接損傷胰島β細(xì)胞[6]。同時(shí)，TNF-α可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合酶（NOS）及一氧化氮（NO）表達(dá)增加，加快胰島β細(xì)胞的凋亡[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用STZ 造模后，大鼠血糖明顯升高，胰腺組織中胰島數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核偏心分布，有的有空泡變形的現(xiàn)象。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，胰島β細(xì)胞TNF-α表達(dá)增高。有研究表明，糖尿病大鼠模型中胰腺組織TNF-α可能直接作用于胰島細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，STZ 所致的糖尿病模型中，TNF-α參與了胰島β細(xì)胞的損傷，使胰島功能受損，胰島素分泌減少，從而引起糖尿病。14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯治療后，高劑量組和低劑量組空腹血糖均下降，胰腺組織形態(tài)學(xué)改變較模型組減輕，胰島β細(xì)胞TNF-α表達(dá)降低。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯可以降低胰島β細(xì)胞TNF-α表達(dá)，與覃林花等[9]報(bào)道的穿心蓮內(nèi)酯能抑制活化巨噬細(xì)胞分泌TNF-α相一致。推測14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯通過降低TNF-α的表達(dá)，減輕TNF-α介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，減輕胰腺組織的損傷，從而起到降低血糖治療糖尿病的作用。

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