王 燕 薛 丹 王銳利 張淑秋

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，山西太原 030001

青蒿素（ART）是一種含獨(dú)特內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯，由我國科學(xué)工作者從菊科植物黃花蒿中提取分離。對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到一系列衍生物，其中雙氫青蒿素（DHA）是除ART 外其他衍生物在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物[1]。蒿甲醚（AM）是ART的醚類衍生物，其抗瘧作用強(qiáng)于ART，不良反應(yīng)輕微，且具有退熱效應(yīng)[2]。ART 類藥物是目前唯一一類未產(chǎn)生明顯耐藥性的抗瘧藥，因而廣泛用于瘧疾特別是惡性瘧疾的治療，此外還有抗炎、抗腫瘤、抗心律失常、抗病毒、免疫抑制、抗血吸蟲等藥理作用[2-3]。

噻唑藍(lán)（MTT）法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，該法靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速[4]。本課題采用MTT 法測定上述3 種藥物對結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS174T增殖的影響，觀察不同濃度藥物以及作用不同時間的細(xì)胞毒作用。實(shí)驗結(jié)果將為后期從基因水平闡釋ART 類藥物對CYP3A4 和CYP2B6 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用提供參考濃度，同時也為研究ART 類藥物抗癌活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LS174T（中科院上海細(xì)胞庫），DMEM 培養(yǎng)基（Thermo scientific），胎牛血清（北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司），100×青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司），0.25%胰蛋白酶-乙二酸四乙胺（EDTA）消化液（北京索萊寶科技有限公司），MTT（sigma），二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司），ART、DHA、AM 標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）。

1.2 儀器

MDF-U32V 型超低溫冰箱（SANYO），DK-98-ⅡA 型電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），TDF-5-A型臺式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），311型CO2培養(yǎng)箱（Thermo scientific），SW-CJ-1F型生物凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），BDS200型倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司），TBS-108型往復(fù)式脫色搖床（海門其林貝爾儀器廠），BT25S型電子天平（德國Sartorius），Variskan Flash型全波長多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）等。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清、100 ×青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，傳代。

1.4 細(xì)胞接種

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至5 ×104個/mL。取96孔培養(yǎng)板，預(yù)先設(shè)定空白孔（培養(yǎng)基），溶劑對照孔（細(xì)胞、溶劑、培養(yǎng)基），加藥孔（藥物、細(xì)胞、溶劑、培養(yǎng)基），均設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞懸液接種于96 孔板中央60個孔內(nèi)，每孔200 μL，其余孔加磷酸鹽緩沖液（PBS）。將接種好的96 孔培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 加藥干預(yù)

將溶于DMSO的藥物（1 000 ×）加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，使DMSO 濃度為0.1%。細(xì)胞匯合度達(dá)80%時，取出，吸去舊培養(yǎng)基，加藥孔分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基180 μL，對照孔中加入含 0.1%DMSO 培養(yǎng)基 180 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。

1.6 觀察細(xì)胞形態(tài)

將96 孔板置于倒置顯微鏡下，觀察溶劑對照組和加藥組細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化并拍照記錄。

1.7 呈色

24 h后，每孔加入新鮮配置的MTT 溶液20 μL，放入培養(yǎng)箱中。4 h后小心棄去孔內(nèi)液體，并用濾紙吸干，每孔加入200 μL DMSO，在搖床上振搖10 min，使沉淀充分溶解。

1.8 測定OD值

用酶標(biāo)儀測定490 nm 處的OD值，并求均值。

1.9 計算抑制率和IC50

按此公式計算抑制率：抑制率（%）=

上述實(shí)驗重復(fù)3次，用OriginPro7.5 軟件計算IC50。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下放大40倍觀察，加藥前細(xì)胞有部分變形，且邊緣清晰；加藥后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞無變形，邊緣模糊，細(xì)胞膜部分消失，細(xì)胞裂解死亡。細(xì)胞形態(tài)見圖1。

2.2 ART、DHA、AM 不同濃度和不同時間對LS174T的抑制作用

ART 作用不同時間對LS174T 細(xì)胞的平均抑制率結(jié)果顯示，與對照組比較，各個濃度下的平均抑制率均升高（P＜0.05）。DHA 作用不同時間對LS174T 細(xì)胞的平均抑制率結(jié)果顯示，與對照組比較，各個濃度下的平均抑制率均升高（P＜0.05）。AM 作用不同時間對LS174T 細(xì)胞的平均抑制率結(jié)果顯示，與對照組比較，各個濃度下的平均抑制率均升高（P＜0.05）。ART、DHA、AM 各濃度作用 24、48、72 h對LS174T 細(xì)胞的平均抑制率分別見表1、2、3。變化趨勢及IC50分別見圖2。

圖1 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)

表1 青蒿素作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

表1 青蒿素作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；另，由于對照組平均抑制率為“0”，為了便于統(tǒng)計，分析時將對照組設(shè)為“1”進(jìn)行

組別 濃度（μmol/L）平均抑制率24 h 48 h 72 h加藥組對照組40 80 120 160 200 240 0 7.31±0.44*10.30±0.25*17.68±1.87*22.53±1.91*27.24±3.67*34.60±2.33*0 8.66±2.61*14.03 ±1.66*26.01±0.78*30.95±2.15*37.08 ±2.68*44.92 ±5.12*0 9.64±3.09*24.77±2.62*32.25±6.58*36.85±2.48*47.17±4.07*53.91±1.39*0

表2 雙氫青蒿素作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

表2 雙氫青蒿素作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05）；“-”表示無數(shù)據(jù)；另，由于對照組平均抑制率為“0”，為了便于統(tǒng)計，分析時將對照組設(shè)為“1”進(jìn)行

組別 濃度（μmol/L）平均抑制率24 h 48 h 72 h加藥組10.61 ±3.17*25.60 ±5.54*52.53 ±3.44*56.46±4.08*93.05 ±0.93*95.79 ±0.70*對照組10 20 40 60 80 100 120 0 7.52±2.19*21.37±2.04*26.59±1.13*35.80±1.99*40.98±2.08*51.25±1.01*67.04±0.80*0 11.54±2.40*23.65±6.04*28.85±6.93*36.71±0.31*45.34±3.95*56.69±1.57*77.16±0.44*0-0

3 討論

MTT 法廣泛用于檢測細(xì)胞對藥物的敏感性[5]，其原理為活細(xì)胞在其生長和增殖過程中，線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS綠色的MTT 降解成紫藍(lán)色的化合物甲臜，沉積于細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞則不能代謝MTT。甲臜溶解后可測定吸光度OD值，OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，接種的細(xì)胞量直接影響到測定結(jié)果。因此，需要選擇一個細(xì)胞濃度，與 OD 值有良好線性關(guān)系。分別設(shè)定 2 ×105、1 ×105、5 ×104個/mL 三個濃度加藥干預(yù)后測OD值，從中選擇一個最優(yōu)濃度進(jìn)行實(shí)驗。發(fā)現(xiàn)5 ×104個/mL組OD值在0.2～0.8 之間，隨濃度變化趨勢較明顯。故選擇接種濃度5 ×104個/mL。

表3 蒿甲醚作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

表3 蒿甲醚作用不同時間對LS174T細(xì)胞的平均抑制率（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05）；另，由于對照組平均抑制率為“0”，為了便于統(tǒng)計，分析時將對照組設(shè)為“1”進(jìn)行

組別 濃度（μmol/L）平均抑制率24 h 48 h 72 h加藥組對照組40 80 120 160 200 240 280 320 0 9.95±1.12*13.56±1.89*19.46±3.51*23.40±1.98*33.24±2.88*39.10±2.56*42.78±4.05*46.69±415*0 14.27±0.99*22.36±1.55*25.34±0.67*30.84±5.53*41.58±2.81*49.95±0.86*53.05±2.50*56.83±3.88*0 25.49±6.93*35.53 ±8.82*37.10 ±4.51*44.79±7.16*58.15±8.91*67.46±5.30*76.55±2.67*81.87±4.75*0

圖2 ART、DHA 及AM的時效曲線和量效曲線

ART、DHA、AM 脂溶性高，選擇DMSO 作為溶劑時，DMSO＞0.1%對細(xì)胞生長有影響[6]。因此，需要先用DMSO配成1000×儲備液，再用含血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實(shí)驗中 240 μmol/L ART 作用 24、48 h 和 320 μmol/L AM 作用24 h 未達(dá)到IC50，但繼續(xù)加大濃度藥物會析出，使細(xì)胞與藥物接觸不均勻，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，因此未進(jìn)行更高濃度的考察。

近來研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，ART 類藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期分布，因而具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。體外實(shí)驗也已證實(shí)對人乳腺癌細(xì)胞HTB27、白血病細(xì)胞K562[9]、肝癌HepG2[10]等有抑制作用。本實(shí)驗室后期實(shí)驗要在LS174T 細(xì)胞中研究ART 類藥物的自身誘導(dǎo)代謝機(jī)制，對藥物干預(yù)濃度的選取就需要兼顧細(xì)胞毒作用，因為細(xì)胞毒作用可能掩蓋誘導(dǎo)作用。但青蒿素類藥物是否影響結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS174T的生長仍不明確。本實(shí)驗采用MTT法測定了3 種ART 類藥物對LS174T 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明隨著藥物濃度和作用時間的增加，藥物對細(xì)胞的抑制率也相應(yīng)增加，呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性。比較IC50發(fā)現(xiàn)，DHA 抑制作用最強(qiáng)，AM次之，ART最弱。結(jié)合倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞數(shù)量減少及細(xì)胞碎裂、死亡等形態(tài)學(xué)變化。說明ART 類藥物對LS174T 也有抑制作用，但比較其他細(xì)胞系，對LS174T的抑制濃度偏高。因此，后續(xù)實(shí)驗設(shè)定藥物干預(yù)濃度時，可選擇的濃度范圍較廣。DHA對LS174T的抑制作用較強(qiáng)，且不良反應(yīng)輕微，可為臨床治療結(jié)腸腺癌提供依據(jù)。

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