李 赫， 王東亮， 趙洪文△

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸病研究所，遼寧沈陽110001;2中國人民解放軍第202醫(yī)院呼吸科，遼寧沈陽110812)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是以肺動脈壓力持續(xù)增加為特征，表現(xiàn)為右心室后負(fù)荷增加和活動耐量下降，多見于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、先天性心臟病患者和肺動脈栓塞等［1］。肺血管的舒縮功能異常、血管重構(gòu)以及動脈內(nèi)血栓形成是造成肺動脈阻力增加的主要原因，但關(guān)于肺動脈高壓確切的病理生理機(jī)制目前仍未完全闡明［2-4］。有研究表明，肺動脈高壓患者肺動脈內(nèi)過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的表達(dá)顯著下降，而PPARγ配體有顯著的心血管代謝保護(hù)作用，可通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)/一氧化氮(nitric oxide，NO)途徑改善血管內(nèi)皮依賴性的舒張功能，降低血壓，同時，還可改善糖、脂代謝等［5］。羅格列酮(rosiglitazone，ROZ)是PPARγ高選擇性的激動劑，可通過增加心血管系統(tǒng)NO的生成，改善心血管系統(tǒng)的血管功能，對血管的重塑也有良好的抑制作用［6］。本研究以目前公認(rèn)的野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型為基礎(chǔ)，從體內(nèi)及體外兩方面探討羅格列酮對肺血管功能的影響及其作用與PPARγ的關(guān)系。

材料和方法

1 主要材料與試劑

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)均按中華人民共和國衛(wèi)生部動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。健康清潔級雄性SD大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)40只，鼠齡8周，體重290～310 g，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要儀器與試劑 電子天平(Shangping JA 21002);托盤天平(JA4103型，上海天平儀器廠);小血管張力測定儀(Multi Myograph System，DMT 610M型);顯微鏡(XYH-3A型，上海永亨光學(xué)儀器制造公司);TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon);去離子水過濾器(Minipore);4，5-二氨基熒光素二乙酸酯(4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA;NO 的熒光探針，Sigma-Aldrich);DMSO(上海生工生物工程有限公司);內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)和NO ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所);PPARγ的特異性阻斷劑GW9662(Sigma);野百合堿(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型建立［7］按隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠分為:正常對照組、模型組、羅格列酮組和羅格列酮 +GW9662組，每組10只大鼠。除對照組外，其它各組每只大鼠給予野百合堿60 mg/kg，頸背皮下一次性注射;對照組大鼠僅給予等量生理鹽水于頸背部皮下一次性注射。羅格列酮組在注射野百合堿后，每天給予羅格列酮生理鹽水混懸液(2.0 mg·kg－1·d－1)灌胃，羅格列酮 +GW9662組在注射百合堿后，每天給予羅格列酮生理鹽水混懸液(2.0 mg·kg－1·d－1)+GW9662(0.3 mg·kg－1·d－1)灌胃;對照組及模型組則給予等體積的生理鹽水灌胃。

2.2 血漿NO和ET-1的測定 大鼠在干預(yù)4周后，禁食24 h，以10%烏拉坦按1 g/kg體重腹腔注射麻醉后，腹主動脈取抗凝血，離心后取血漿以ELISA法測血漿中ET-1和NO含量，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說明書執(zhí)行。

2.3 肺動脈血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn) 大鼠以10%烏拉坦麻醉取血后，打開胸腔，迅速取出雙肺，放入冷生理鹽溶液(physiological salt solution，PSS)中，在解剖顯微鏡下小心除去肺動脈周圍組織，截取長約2～2.5 mm的肺動脈二級分支。在顯微鏡下用40 μm的不銹鋼絲穿過血管，將帶有鋼絲的血管環(huán)固定在微血管張力測定儀上，并將其放入充滿37℃ PSS的浴槽中，浴槽持續(xù)通以5%CO2和95%O2的混合氣體。在平衡約15 min后利用張力微調(diào)旋鈕調(diào)節(jié)初張力并逐漸穩(wěn)定在2 mN。用KCl(60 mmol/L)刺激血管3次，每次約10 min，在穩(wěn)定10 min后，用PSS液洗滌3次，每次3～5 min，如此反復(fù)3次。PSS配方(mmol/L):NaCl 119，NaHCO325，葡萄糖 11.1，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，pH 7.4。

乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng):以苯腎上腺素(phenyllphrine，PE)10－5mol/L預(yù)收縮血管，待血管反應(yīng)達(dá)平臺后，加入不同濃度的ACh(10－9～10－5mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。舒張反應(yīng)功能以ACh的舒張幅度占PE預(yù)收縮幅度的百分比表示。

硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)誘導(dǎo)的血管非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng):以PE 10－5mol/L預(yù)收縮血管，待血管反應(yīng)達(dá)平臺后，加入不同濃度的NTG(10－9～10－5mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。舒張反應(yīng)以NTG的舒張幅度占PE預(yù)收縮幅度的百分比表示。結(jié)果以采用GraphPad Prism 3.0軟件作圖并計算。

2.4 羅格列酮對HPAECs細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響(1)細(xì)胞的培養(yǎng):HPAECs細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%鏈霉素－青霉素溶液)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞完全融合后，用于下列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(2)NO熒光的測定方法:將105個細(xì)胞接種到預(yù)先放置2 cm×2 cm無菌蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入5 mmol/L DAF-2DA(NO的熒光探針)，37℃避光孵育45 min。用PSS洗滌3次后將蓋玻片取出置于熒光顯微鏡下，在FITC濾光片下用40倍物鏡進(jìn)行照相后用軟件進(jìn)行熒光值測定計算。(3)羅格列酮對HPAECs細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響:細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，分為對照組、羅格列酮組(濃度為1 μmol/L)和羅格列酮+GW9662組(羅格列酮和GW9662的濃度均為1 μmol/L)，將羅格列酮溶于DMSO中，待細(xì)胞于6孔板中貼壁后，給予上述藥物干預(yù)24 h后進(jìn)行NO熒光測定。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠的一般情況觀察結(jié)果

注射野百合堿2周后，部分大鼠開始出現(xiàn)活動遲緩、體重增長緩慢的表現(xiàn)，3周后部分大鼠進(jìn)食減少，呼吸急促，甚至在口鼻周圍出現(xiàn)血性分泌物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過解剖發(fā)現(xiàn)多數(shù)肺動脈高壓大鼠均出現(xiàn)不同程度的胸腔積液，肺部水腫明顯，肝臟充血。模型組肺動脈壓力 ［(45.11±3.08)mmHg］顯著高于對照組［(16.98 ±1.34)mmHg］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2 羅格列酮對肺動脈高壓大鼠血漿NO和ET-1的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血漿中ET-1含量顯著增加，而NO含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，羅格列酮干預(yù)可顯著升高血漿中的NO水平，降低ET-1水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);但羅格列酮的上述作用在同時給予PPARγ的阻斷劑GW9662后被顯著減弱，與羅格列酮組比較，差異顯著(P＜0.01)，見表1。

表1 羅格列酮對肺動脈高壓大鼠血漿ET-1和NO含量的影響Table 1.The effects of rosiglitazone(ROZ)on ET-1 and NO levels in pulmonary hypertensive(PH)rats(mean±SD.n=10)

3 羅格列酮對肺動脈高壓大鼠肺動脈血管功能的影響

與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠肺動脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能嚴(yán)重受損，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1A;而非內(nèi)皮依賴性舒張功能受損不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1B。與模型組比較，羅格列酮干預(yù)可顯著改善肺動脈高壓大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，但羅格列酮的作用在給予PPARγ阻斷劑GW9662后被顯著減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Comparison of endothelium-dependent(A)and endothelium-independent(B)relaxation of pulmonary arteries between control group and pulmonary dypertension(PH)group.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.圖1 模型組與對照組血管舒張功能的比較

Figure 2.Rosiglitazone(ROZ)improved endothelium-dependent relaxation of pulmonary arteries in pulmonary hypertensive(PH)rats.Mean ± SD.n=10.*P ＜ 0.05 vs PH;#P ＜0.05 vs ROZ.圖2 羅格列酮改善肺動脈高壓大鼠肺動脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能

4 羅格列酮及GW9662對HPAECs生成NO的影響

與對照組比較，給予羅格列酮孵育后，HPAECs的NO生成量顯著增加，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而同時以羅格列酮和PPARγ阻斷劑GW9662孵育后，熒光強(qiáng)度減弱，說明羅格列酮的作用被GW9662顯著減弱，羅格列酮組與羅格列酮+GW9662組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3。

討 論

Figure 3.Rosiglitazone(ROZ)increased NO production in HPAECs in a PPARγ -dependent manner.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs ROZ.圖3 羅格列酮以PPARγ依賴的方式升高HPAECs中NO的水平

研究表明，在各種誘因下使肺動脈內(nèi)皮受損是肺動脈高壓產(chǎn)生的起始環(huán)節(jié)［8］，當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放調(diào)節(jié)血管舒張和防止血管增殖的內(nèi)皮舒張因子——NO的水平下降，而對血管有強(qiáng)烈收縮作用和促進(jìn)血管增殖的 ET-1水平則顯著上升［9］。因此，外周血循環(huán)中NO和ET-1水平可能在一定程度上反映了血管內(nèi)皮功能［10］。當(dāng)病因不能去除而持續(xù)存在時，如COPD和先天性心臟病，肺動脈就會發(fā)生血管重塑和血管舒縮功能的改變［11］，從而導(dǎo)致不可逆的肺動脈高壓，乃至出現(xiàn)肺心病和心力衰竭。目前常見肺動脈高壓動物模型包括野百合堿注射、慢性低氧、單純左肺葉切除以及腹主動脈－腔靜脈分流等。而由于野百合堿是雙吡咯類生物堿，在肝臟內(nèi)經(jīng)P450單氧化酶轉(zhuǎn)化后，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肺臟，能夠選擇性損傷肺血管內(nèi)皮，引起慢性血管炎性病變，更接近臨床發(fā)病的機(jī)制;加上該造模方法成功率高、操作簡便、重復(fù)性好而較為廣泛應(yīng)用［7，12］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們以野百合堿皮下注射成功地復(fù)制出大鼠的肺動脈高壓模型，大體表現(xiàn)為大鼠出現(xiàn)胸腔積液，肺部水腫明顯，肝臟充血以及鏡下的肺血管重塑以及血管周圍炎癥浸潤。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓大鼠模型組大鼠血漿中ET-1含量顯著增加，而內(nèi)源性的NO含量顯著下降，提示血管內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損;而羅格列酮可顯著升高肺動脈高壓大鼠血漿NO的水平，降低ET-1的水平，表明羅格列酮可能具有改善肺動脈高壓大鼠肺動脈內(nèi)皮功能的作用。NO通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，升高環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量，降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平，促使肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，導(dǎo)致平滑肌松弛，血管舒張。而內(nèi)源性NO是由內(nèi)皮型NO合酶催化L-精氨酸與氧結(jié)合后釋放的［13］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞存在時，乙酰膽堿可以促進(jìn)血管內(nèi)皮釋放NO，因此，乙酰膽堿對血管的舒張作用依賴于內(nèi)皮的存在，在病理狀態(tài)下，如高血壓、動脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮明顯受損的情況下，乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)會明顯下降。硝酸甘油為NO的直接供體，其舒張血管的作用不依賴于血管內(nèi)皮的存在，為非內(nèi)皮依賴性血管舒張劑［14］。在本研究中，羅格列酮可改善乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)，而對于硝酸甘油誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)，各組間無顯著差異，說明羅格列酮改善肺動脈高壓大鼠肺動脈血管舒張功能是血管內(nèi)皮依賴性的。

近年的研究結(jié)果表明PPARγ的受體激動劑具有顯著的心血管代謝保護(hù)作用，PPARγ受體激動劑通過PI3K/Akt/NO信號通路可顯著改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能［3］。研究還表明PPARs(包括PPARγ，PPARδ等)與肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，在肺動脈高壓的肺組織中，PPARγ蛋白表達(dá)顯著下降［15-16］。亦有研究表明 PPARγ激活后可抑制血管的重塑［6］，但PPARγ激動劑是否對肺動脈高壓具有防治作用則未見確切的具體報道。目前已證實(shí)，羅格列酮是PPARγ的激動劑［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可顯著增加HPAECs的NO生成，而PPARγ阻斷劑GW9662可顯著阻斷羅格列酮的作用。以上研究結(jié)果提示:羅格列酮改善肺動脈高壓大鼠肺血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用可能是通過激活PPARγ受體減少ET-1的生成，增加肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生而起作用的。

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