齊一鳴， 黃俊琪

(中山大學中山醫(yī)學院免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室，廣東廣州510080)

登革熱是是世界上最常見的蚊媒傳播疾病之一，但目前仍缺乏合適的實驗動物模型和特異性的治療手段，也沒有安全的疫苗可以預防其傳播。對于重癥型的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)或登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)，血管內皮損傷導致的血漿滲漏及出血是其主要的臨床特征。國內外均有研究表明，2型登革病毒(dengue virus type 2，DEM-2)可以直接或間接誘導宿主的血管內皮細胞凋亡［1-3］，然而，通過何種途徑誘導凋亡卻觀點各異。本研究主要通過對登革病毒感染前后EA.hy926細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)變化情況及 caspase-9 活性的觀察，討論線粒體凋亡途徑是否也參與了DHF或DSS的發(fā)病機制。

材料和方法

1 材料

1.1 病毒與細胞系 DENV-2 NGC病毒株來自中山大學中山醫(yī)學院微生物學教研室，由本室進行擴增定量和保存。EA.hy926細胞由人血管內皮細胞及A549肺癌上皮細胞融合而成，由中山大學中山醫(yī)學院干細胞中心贈予。

1.2 主要試劑及檢測儀器 培養(yǎng)基DMEM/F12、胎牛血清和青鏈霉素雙抗為Gibco。噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］為Sigma產品。檢測JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒為Genmed產品，流式細胞儀FACSCalibur為BD產品，熒光顯微鏡Axio Observer Z1為Carl Zeiss產品，酶標儀為BioTek產品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) EA.hy926細胞用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)及傳代。

2.2 登革病毒感染 取2型登革病毒液定量至(109pfu/L)，加入EA.hy926細胞培養(yǎng)瓶中，感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為4，吸附1 h。棄上清，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下維持培養(yǎng)，分別于24 h、36 h和48 h后棄去培養(yǎng)液，收集細胞。

2.3 MTT法 收集處于對數(shù)生長期的EA.hy926細胞調整細胞至5 000 cells/well，鋪于96孔板中，于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，對照組加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，感染組加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及DENV病毒液5 μL，每個組設6個平行孔。分別培養(yǎng)24 h、36 h和48 h后，每孔加入1 g/L MTT溶液50 μL，37℃孵育4 h。棄上清，加入100 μL DMSO使結晶溶解。室溫下輕度振蕩15 min，1 h內用酶標儀測出570 nm處的A值。以下公式計算出DENV-2對EA.hy926細胞生長的抑制率:細胞生長抑制率(%)=(未感染細胞A值－感染細胞A值)/未感染細胞A值×100%。

2.4 線粒體膜電位的檢測 取對數(shù)期生長的EA.hy926細胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min 離心5 min，PBS洗滌2遍。流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測均按照試劑盒說明書進行。

2.5 Caspase-9活性檢測 采用caspase-9活性蛋白酶檢測試劑盒(Invitrogen)測定。裂解EA.hy926細胞提取總蛋白，定量并稀釋至終濃度2 mg/L。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。于波長405 nm處讀取A值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料用(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DENV-2感染EA.hy926細胞后對細胞活性的抑制

MTT檢測發(fā)現(xiàn)，EA.hy926在感染DENV-2 24 h、36 h及48 h后細胞活性受到顯著抑制，550 nm處的A 值分別為1.204 ±0.042、1.216 ±0.057 和1.293 ±0.087，各個時點均低于未感染組(0.730 ± 0.141、0.433±0.034 和 0.360 ±0.113)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)。隨時間的延長，感染組細胞活性持續(xù)降低而未感染組幾乎無差異，見圖1。

Figure 1.EA.hy926 cell growth inhibtion after DENV-2 infection for 24 h，36 h or 48 h detected by MTT assay.Mean±SD.n=6.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs uninfected.圖1 DENV-2感染 EA.hy926細胞24 h、36 h、48 h后細胞活性變化

2 流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化

JC-1可以以單體或聚合體的形式積聚于線粒體中。在線粒體發(fā)生去極化時，JC-1以單體形式占主導，發(fā)射綠色熒光(～530 nm);當電位復極至－140 mV甚至更高時，則主要以聚合物形式存在并發(fā)射紅色熒光(～590 nm)。借助JC-1復合體不同形式所發(fā)射的紅色/綠色熒光比值(FL2/FL1)，可以表示線粒體膜電位的改變。DENV-2感染24 h、36 h及48 h后，感染組 Δψm均值分別為3.15±0.28、2.23±0.36和2.40±0.49;未感染組為4.80±0.33、3.48±0.43和3.23±0.20。感染組各時點均較未感染組低，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)，且感染組Δψm的最低點出現(xiàn)在感染后36 h，見圖2、3。

Figure 2.Mitochondrial membrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h detected by flow cytometry.圖2 流式細胞術檢測DENV-2感染24 h、36 h和48 h后EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

Figure 3.Mitochondrialmembrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs uninfected.圖3 DENV-2感染24 h、36 h和48 h后 EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

3 熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的變化

未感染組隨著時間的增加，雖然胞漿內散在的紅色顆粒逐漸減少，但是綠色熒光基本無變化;感染組綠色熒光增強，紅色熒光則在36 h表達最弱。與流式細胞術檢測結果一致，見圖4。

Figure 4.Mitochondrialmembrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h detected by fluorescence microscopy.Scale bar=20 μm.圖4 熒光顯微鏡觀察 DENV-2感染24 h、36 h、48 h后EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

4 感染后caspase-9活性的變化

DENV-2感染后，24 h即可出現(xiàn)caspase-9活性上升，且其活性隨著時間的延長而逐漸增加。感染組24 h、36 h及48 h caspase-9活性的 A值分別為0.134 ±0.010、0.137 ±0.010 和 0.140 ±0.020，未感染組分別為0.038 ±0.010、0.038 ±0.010 和 0.040±0.010，2組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖5。

Figure 5.Caspase-9 activity in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs uninfected.圖5 DENV-2感染 EA.hy926細胞24 h、36 h和48 h后caspase-9活性的變化

討 論

細胞凋亡或程序化死亡是機體抵抗微生物入侵、去除被感染細胞、限制病原擴散的重要病理生理過程［4］。我們前期的研究已經證實，DENV-2感染可以通過活化Fas/FasL及caspase級聯(lián)反應誘導原代的 HUVECs發(fā)生凋亡，以 48 h 最明顯［5-6］。而EA.hy926細胞來源于 HUVECs，同樣具有內皮細胞的特性，我們在誘導EA.hy926細胞發(fā)生凋亡時則在感染36h后凋亡率增加最為顯著［7］。本組實驗結果顯示，細胞生長的抑制率隨著感染時間的延長而增加，48 h達峰值。外源性MTT通過檢測活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的數(shù)量來間接反映活細胞的數(shù)量［8］，而感染組細胞較未感組活細胞數(shù)量減少，即線粒體總琥珀酸脫氫酶的含量減少，這就提示了線粒體也可能參與了DENV-2誘導EA.hy926細胞發(fā)生凋亡的途徑。線粒體是程序化死亡信號轉導途徑中起關鍵調節(jié)作用的細胞器。線粒體膜電位的破壞被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件之一［9］。為了進一步探究線粒體是否參與了DENV-2感染后EA.hy926細胞發(fā)生凋亡的通路，我們通過JC-1染色檢測了Δψm的變化。流式細胞術和熒光顯微鏡的結果都顯示，DENV-2作用EA.hy926細胞后，Δψm降低并在36 h最為明顯，晚于MTT活性抑制高峰的48 h。但考慮到MMP變化是凋亡早期事件，應早于或同時于凋亡的發(fā)生，故兩高峰產生了時間差異。線粒體膜電位降低后，引起膜通道非特異開放，細胞色素酶C從內膜脫落出來并釋放到胞質中，進而與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic proteinase-activating factor 1，Apaf1)結合形成復合物，激活pro-caspase-9，隨之活化caspase-9。而caspase-9的激活是啟動caspase級聯(lián)放大反應、誘發(fā)細胞凋亡的第一步［10］。本結果顯示，DENV-2感染后早期即可出現(xiàn)caspase-9活性的顯著增高，并且維持在相對高水平。

以往文獻多報道使用線粒體標記物羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)來檢測 Δψm，但是 Rh123 容易發(fā)生自身淬滅，而且產生較強的非線性反應，不易定量，僅可作為一種定性的檢測手段。更重要的是，Rh123具有濃度依賴性，在濃度大于1 μmol/L時即可影響線粒體的呼吸作用及ATP酶的活性，當濃度達10 μmol/L時可引起更嚴重的線粒體腫脹，不僅在早期影響Δψm的改變，還使得后期的凋亡結果出現(xiàn)更多的假陽性［11］。而本研究采用的JC-1對染色細胞內的膜電位變化較Rh123雖敏感性稍低，但也因此它可以更為真實一致的反應線粒體的去極化，假陽性少。聚合體散發(fā)的紅色熒光，可以線性反映Δψm的改變，而使用參比的方法使JC-1檢測的靈敏度更高。另外，實驗也證明，JC-1在濃度為 550 nmol/L時對線粒體的呼吸作用基本沒有影響，當增大濃度至10 μmol/L時，細胞存活率仍可維持在95%以上［12］。本研究中，標記 EA.hy926細胞線粒體的JC-1濃度為1 μmol/L，因此，對于細胞活性和形態(tài)幾乎沒有不良作用。另外，在進行EA.hy926細胞感染時，我們采用了含2%血清的培養(yǎng)基替換了正常培養(yǎng)條件下含10%血清的培養(yǎng)基，以減少對病毒擴增、感染能力的抑制。研究發(fā)現(xiàn)，血清濃度可顯著影響病毒的增殖能力，牛血清濃度在2%時，病毒可達到最快的增殖速度和最高的滴度;同時，該濃度也可以較持久地維持細胞的生命狀態(tài)，保證感染過程的順利進行［13］。

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