楊 成， 董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241002)

石榴皮Pericarpiu Granati系石榴科 Punica granatum Linn．石榴屬植物石榴的干燥果皮。由于石榴皮中含鞣質(zhì)較多，因而石榴皮常具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗突變、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，但關(guān)于其鞣質(zhì)是否具有抗過敏活性尚未見報道［1-3］，其它關(guān)于石榴皮免疫功能的研究報道也限于免疫調(diào)節(jié)方面［4-6］。本實驗擬對石榴皮提取物抗過敏活性進行了實驗，以便為深入利用石榴皮提供實驗參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 干燥石榴皮、天花粉 (購自蕪湖市張恒春大藥房)，息斯敏 (西安楊森制藥有限公司)，透明質(zhì)酸酶 (購自Sigma公司)，小鼠組胺ELISA檢測試劑盒 (購自上海研生生化試劑有限公司 )，甲醇，透明質(zhì)酸鉀，硫酸鋁等其它均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物 清潔級昆明系小鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［動物合格證號:SCXK(蘇)2007—0001］。

2 方法

2.1 石榴皮提取物制備 500 g石榴皮于烘箱烘干，磨碎40目獲得粗粉。以甲醇為提取溶劑，按質(zhì)量與提取劑體積比1∶10(w/v)，4℃提取12 h過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃真空濃縮至干作為樣品備用。

2.2 石榴皮體外抗過敏試驗 參照文獻［7］透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗，測定石榴皮提取物對透明質(zhì)酸的活性的抑制效應(yīng)。向0.5mL酶活力單位為400 u/mL透明質(zhì)酸酶中加入2.5 mmol/L CaCl20.1mL，37℃溫浴20 min，加入生理鹽水溶解的待測質(zhì)量濃度分別為2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 mg/mL石榴皮提取物0.5 mL、37℃溫浴20 min，加入0.4 mg/mL透明質(zhì)酸鉀0.6mL，37℃溫浴40min，加0.1mol/L NaOH 0.2 mL終止反應(yīng)，冰浴10 min，加1%硼酸0.1 mL，煮沸5 min，冰浴10 min，加2mL P-DAB試劑37℃溫浴20 min，585 nm下測定OD值。分別將樣品、透明質(zhì)酸酶替換為0.1mol/L pH4醋酸緩沖液設(shè)為對照和樣品空白對照，將樣品、透明質(zhì)酸酶替換為醋酸緩沖液作為對照空白。

抑制率(%)=［(A－B)－(C－D)］/(A－B)×100%

A為對照管OD585;B為對照空白管OD585;C為樣品OD585;D為樣品空白對照管OD585。

2.3 石榴皮體內(nèi)小鼠被動皮膚過敏試驗

2.3.1 致敏及抗血清的制備 健康小鼠6只，體質(zhì)量18～22 g，將3.75 mg天花粉溶于1.5 mL 4%氫氧化鋁凝膠制備懸液腳掌注射，兩只后腳掌各注入0.05 m L，共注射0.1 mL。15 d后，斷頭取血，離心取抗血清備用。

2.3.2 被動皮膚過敏小鼠模型的構(gòu)建 參照文獻 ［8］方法，取實驗小鼠30只，隨機分為正常組，息斯敏 (10 mg/kg)組，提取物高、中、低劑量組 (900 mg/kg，300 mg/kg，100 mg/kg)，每組6只;每天灌胃給藥1次，正常組給等體積蒸餾水，連續(xù)給予7 d。取2.3.1項小鼠混合血清加生理鹽水稀釋成1∶5，每鼠腹壁皮內(nèi)注射兩個點 (相距0.2 cm)，每點0.03 mL。并再連續(xù)給藥2 d，于末次給藥48 h后，每只小鼠進行抗原攻擊，尾靜脈注射2.5mg天花粉 (用1%伊文思藍-生理鹽水配制)0.2 mL，30 min脫臼處死，眼球取血備用，翻轉(zhuǎn)腹部皮膚剪下腹部藍斑皮膚(0.5 g)，剪碎，浸泡于丙酮生理鹽水溶液 (7∶3)5 mL中48 h，離心取上清液，用分光光度計610 nm波長測定吸收度，計算抑制率，評價藥物的抗過敏作用。

抑制率=100%－(用藥組平均光密度/致敏對照組平均光密度)×100%

2.4 血清中組胺釋放水平的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法試劑盒測定，嚴格按說明進行操作。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差 (± s)表示，采用F檢驗進行組間顯著性檢驗;采用Pearson作相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 石榴皮提取物體外透明質(zhì)酸酶抑制抗過敏效果 按照2.2項方法測定不同終質(zhì)量濃度石榴皮提取物對透明質(zhì)酸酶抑制效果，結(jié)果由表1可知，當終質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL時，對透明質(zhì)酸酶的抑制率為43.2%，且抑制活性與樣品終質(zhì)量濃度呈一定量效關(guān)系，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為 2.69 mg/mL。

表1 提取物對透明質(zhì)酸酶的抑制率

3.2 石榴皮提取物體內(nèi)對小鼠被動皮膚抗過敏效果 由表2結(jié)果表明，以伊文思藍滲透量為指標，經(jīng)F分析，F(xiàn)=3.75，F(xiàn)(4，25)=2.76，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，正常組與息斯敏陽性藥物組、高劑量之間存在差異;息斯敏陽性藥物組與低劑量組存在差異。說明與息斯敏相比，高劑量石榴皮提取物能明顯地降低藍斑皮膚浸出液光密度值，顯著地抑制小鼠被動皮膚通透性，減少伊文思藍滲透量，具有一定抗過敏活性。

表2 提取物對小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)的影響( ± s，n=6)

表2 提取物對小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)的影響( ± s，n=6)

注:與息斯敏組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)吸光值(ODA585nm) 抑制率/%正常組 H2O 0.412±0.012 －息斯敏組 0.01 0.179±0.019△ 56.5石榴皮高劑量組 0.9 0.214±0.018△ 48.1石榴皮中劑量組 0.3 0.285±0.026 30.8石榴皮低劑量組 0.1 0.352±0.031*14.5

3.3 不同給藥組別小鼠血清組胺的水平 由表3結(jié)果，經(jīng)F分析，F(xiàn)=5.69，F(xiàn)(4，25)=2.76，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與正常組和息斯敏陽性藥物組相比，石榴皮提取物中劑量、高劑量能顯著降低實驗小鼠血清中組胺濃度，尤其是高劑量，其效果均好于息斯敏陽性藥物組，低劑量效果較差。結(jié)果提示，石榴皮提取物能減少過敏介質(zhì)組胺的釋放，具有一定的抗過敏作用。

表3 提取物對小鼠血清組胺水平的影響 ( ± s，n=6)

表3 提取物對小鼠血清組胺水平的影響 ( ± s，n=6)

注:與息斯敏組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1) 組胺/(μg·L－1)正常組 H2 O 14.3±1.04息斯敏組 0.01 10.4±0.82△石榴皮高劑量組 0.9 8.9±0.75△石榴皮中劑量組 0.3 11.2±1.40△石榴皮低劑量組 0.1 13.9±0.60*

3.4 小鼠血清組胺水平與伊文思藍滲出量相關(guān)性分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，對各組小白鼠被動皮膚過敏反應(yīng)的伊文思藍滲透量光密度與血清組胺含量二者的相關(guān)性進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果散點圖見圖1，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，伊文思藍滲透量光密度與血清組胺水平在各實驗組之間存在一定的相關(guān)性，P值為0.007，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.48。

圖1 組胺水平與伊文思藍吸光值相關(guān)性散點圖

4 討論

現(xiàn)代中藥關(guān)于抗過敏機制的研究多集中在過敏介質(zhì)和Th1/Th2平衡理論［9-10］。而過敏反應(yīng)是機體受到某些抗原刺激后出現(xiàn)生理功能紊亂或組織細胞損傷的異常適應(yīng)性免疫應(yīng)答。中醫(yī)常認為對過敏癥需從內(nèi)調(diào)整，健脾補腎，調(diào)整機體免疫系統(tǒng)的紊亂，使機體整體功能得到恢復(fù)，對自然環(huán)境由不適應(yīng)變?yōu)檫m應(yīng)，如此方可達到防治的最終目的。透明質(zhì)酸酶是透明質(zhì)酸的特異性裂解酶，與炎癥、過敏等病理癥狀存在明顯的相關(guān)性［11］。抑制透明質(zhì)酸酶的活性可使透明質(zhì)酸不被分解，對維持正常的生理功能，減少過敏反應(yīng)具有重要意義。而且有研究顯示透明質(zhì)酸酶活性和組胺之間存在明顯的相關(guān)性，透明質(zhì)酸酶活性的抑制實驗已經(jīng)作為篩選抗過敏藥物的基本方法之一［12-13］。組胺是由機體肥大細胞內(nèi)組氨酸脫羧基后產(chǎn)生的一種胺類物質(zhì)，介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)的重要生物活性介質(zhì)，能引起全身毛細血管擴張、通透性增加，平滑肌痙攣。因此，機體內(nèi)組胺水平的變化可作為過敏反應(yīng)的檢測的重要指標。

實驗為提高藥物凈度，確保質(zhì)量，利用甲醇為提取劑，經(jīng)低溫、真空濃縮干燥工藝，結(jié)合透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗和體內(nèi)小鼠皮膚通透性實驗及過敏介質(zhì)組胺釋放量測定，分析了石榴皮甲醇提取物的抗過敏活性，結(jié)果表明石榴皮提取物具有一定的抑制透明質(zhì)酸酶活性，中、高劑量能顯著的阻止過敏介質(zhì)組胺的釋放量，高劑量是能顯著降低小鼠被動皮膚對伊文思藍滲透量，顯示出一定的抗過敏活性，其活性可能與藥物劑量存在一定的量效關(guān)系，也為進一步開發(fā)石榴皮提供參考。但通過何種方式抑制組胺釋放有待進一步了解。通過二者之間相關(guān)性分析，可以看出，血清中組胺的水平與小鼠皮膚對伊文思藍滲透量之間，存在一定的相關(guān)性，但相關(guān)程度不高，相關(guān)系數(shù)僅為0.48，其可能原因，一方面可能是由于實驗檢測樣本過小;另一方面是機體能參與過敏小鼠被對伊文思藍滲透的活性介質(zhì)不僅僅只有組胺一種，如血清中如白三烯、前列腺素等多種活性介素也可能參與。

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