李 辰， 劉志平， 邸多隆

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州510006;2.五邑大學(xué) 分析測試中心，廣東 江門529020;3.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

近年來，利用中藥指紋圖譜技術(shù)鑒別中藥材的方法已有不少報道，如利用氣相色譜-質(zhì)譜法對當(dāng)歸及其炮制品揮發(fā)油的指紋圖譜研究［1］，基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳指紋圖譜技術(shù)對柏子養(yǎng)心丸的質(zhì)量控制方法［2］，利用液相色譜指紋圖譜法對天然和人工培養(yǎng)蟲草進(jìn)行質(zhì)量控制的方法［3-4］等。還有利用生物形態(tài)學(xué)方法對藥材進(jìn)行鑒別的研究，如利用傳統(tǒng)的性狀鑒別結(jié)合薄層色譜、液相色譜對冬蟲夏草、延胡索、黃柏等中藥材進(jìn)行真?zhèn)纹疯b別的方法［5］，利用形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法鑒別研究廣藿香的方法［6］，利用形態(tài)基源識別方法鑒別羌活魚正品及其常見混偽品［7］。然而，上述方法僅對藥材化學(xué)成分、形態(tài)學(xué)或個別成分含有量進(jìn)行質(zhì)量控制或鑒別比較，適合于完整藥材的質(zhì)控識別，且中藥指紋圖譜通常需要經(jīng)過較復(fù)雜繁瑣的試驗(yàn)和運(yùn)算，無法對藥材粉末與其制劑進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒別。因此，開發(fā)中藥材粉末與其制劑真?zhèn)蔚目焖勹b別方法具有重要意義。

冬蟲夏草 Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．和羌活魚Batrachuperus pinchonü主產(chǎn)于我國四川、甘肅、西藏、青海等高原地區(qū)。冬蟲夏草及其制品含有蟲草酸、蟲草素、氨基酸等豐富的活性營養(yǎng)物質(zhì)，具有擴(kuò)張氣管、抗心律失常、降血壓、抗氧化、抗惡性腫瘤、提高機(jī)體免疫力等功效［8-9］。羌活魚作為中藥材，具有行氣止痛，治肝胃氣痛［10］、抗菌［11］、血虛脾弱、續(xù)斷接骨［12］等作用。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了一種利用HPLC-二極管陣列檢測器 (PDA)指紋圖譜、共有峰紫外吸收光譜圖 (UV)、HPLCMS質(zhì)荷比及質(zhì)譜棒狀圖等綜合快速鑒別冬蟲夏草、羌活魚等中藥材與其膠囊制劑的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑 美國Thermo Finnigan Surveyor液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (配PDA二極管陣列檢測器;LCQ Fleet離子阱質(zhì)譜儀);KQ-300超聲波清洗器 (昆山);H1650高速臺式離心機(jī) (長沙湘儀)。

冬蟲夏草、羌活魚 (購于藥店，經(jīng)甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室戚歡陽副研究員鑒定分別為冬蟲夏草Cordyceps sinensis和山溪鯢Batrachuperus pinchonü);蟲草膠囊和羌活魚膠囊 (由某生物科技公司提供);甲醇、乙腈 (色譜純，Burdick＆Jackson公司);超純水 (Millipore Simplicity);磷酸 (分析純，汕頭西隴化工)。

1.2 樣品制備

1.2.1 冬蟲夏草及膠囊樣品溶液的制備 冬蟲夏草經(jīng)粉碎過篩后，取藥材粉末 (60～100目)約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中;另稱取蟲草膠囊內(nèi)容物粉末約0.5 g(每粒膠囊裝藥量約0.15 g)，精密稱定，置另一具塞三角瓶中。兩瓶各加入10 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷過濾，濾渣再各加入10 mL 50%甲醇水溶液，超聲提取30 min。合并兩次濾液，濃縮至干，殘渣以85%甲醇溶解并定容至5mL，于3 000 r/min離心5min，取上清液過0.45μm濾膜，即得。

1.2.2 羌活魚及膠囊樣品溶液的制備 羌活魚經(jīng)粉碎過篩后，取藥材粉末 (60～100目)約1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中;另取羌活魚膠囊制劑內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置另一具塞三角瓶中，兩瓶各加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，放置沉降12 h后，取上清液過0.45μm濾膜，即得。

1.3 分析方法

1.3.1 蟲草及其膠囊制劑的HPLC-PDA條件 參考文獻(xiàn) ［13］，Surveyor Plus HPLC系統(tǒng)，Sinochrom ODS-AP柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為乙腈 (A)和0.1%H3PO4水溶液 (B)，體積流量1.0 mL/min;梯度洗脫，5%A(0 min)→5%A(5 min)→10%A(20 min)→80%A(60 min)→80%A(70 min);波長260 nm(200～400 nm掃描);進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 羌活魚及其膠囊制劑的HPLC-PDA條件Surveyor Plus HPLC系統(tǒng)，Sinochrom ODS-AP色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相為乙腈(A)和H2O(B)，體積流量1.0 mL/min;梯度洗脫，97%B(0 min)→97%B(5 min)→92%B(10 min)→22%B(30 min);波長254 nm;進(jìn)樣量10μL。

1.3.3 羌活魚及其膠囊制劑MS源及離子化模式電噴霧離子源 (ESI)，0～10 min正離子模式(+)，10～40 min負(fù)離子模式 (－)。+4 kV(正離子模式)或－3.5 KV(負(fù)離子模式)噴霧電壓;金屬毛細(xì)管溫度350℃;鞘氣壓力30 bar;輔助氣壓力5 bar;體積流量200μL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 原藥材與膠囊制劑的液相色譜指紋圖譜比對圖1為冬蟲夏草 (A)及其膠囊 (B)提取液的HPLC-PDA色譜圖比對結(jié)果，經(jīng)直觀比對發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草與蟲草膠囊HPLC色譜圖輪廓相近，尤其20 min后出峰的小極性組分，以保留時間適中的色譜峰 (分別為32.081和31.854 min)為參比峰，冬蟲夏草和膠囊樣品相應(yīng)譜峰的相對保留時間 (rt)和相對峰面積 (rA)及其比值計算結(jié)果見表1。由表1數(shù)據(jù)可知，26 min后譜峰的相對保留時間比值rt2/rt1在0.998～1.007之間，誤差小于1%;相對峰面積比值 rA2/rA1在0.96～1.35之間 (33.081 min峰除外)，誤差小于35%，表明膠囊與冬蟲夏草部分成分相同 (rt一致性高)，但膠囊中也添加了其它藥材或添加劑，導(dǎo)致相同成分含有量有所不同 (rA一致性不高)。利用PDA全波長掃描功能(200～400 nm)進(jìn)一步鑒別rt一致譜峰是否為同一化合物。由HPLC-PDA圖譜參考峰的紫外吸收圖 (圖2)，該共有峰的紫外吸收光譜輪廓和最大吸收波長基本一致，進(jìn)一步表明該峰為同一化合物。綜合判斷:該蟲草膠囊內(nèi)容物主要為冬蟲夏草，并添加了其它一些極性成分 (HPLC圖譜較早出峰的化合物)，可能為復(fù)方制劑。

圖1 冬蟲夏草 (A)與蟲草膠囊 (B)HPLC–PDA圖譜Fig.1 HPLC-PDA chromatograms of Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc． (A)and capsule of Cordyceps(B)

表1 冬蟲夏草及其膠囊樣品相對保留值及其比值Tab.1 Relative retention values and their ratios of C．sinensis(Berk．)Sacc ．a(chǎn)nd its capsules

圖2 冬蟲夏草 (a)及待鑒別膠囊 (b)參考峰紫外吸收光譜Fig.2 UV spectrum of the reference peaks of Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．(a)and its capsules(b)

由羌活魚及其膠囊樣品溶液的HPLC-PDA比對圖譜 (圖3)可知，兩者譜圖輪廓及譜峰峰高比例極為接近，進(jìn)一步比對圖譜中的10個主要色譜峰，相對保留時間及其比值列于表2，結(jié)果相對保留時間比值rt2/rt1在0.992～1.014之間，誤差小于1.4%，可知膠囊內(nèi)容物主要成分與羌活魚的基本相同。

圖3 HPLC-PDA色譜圖比對 (a為羌活魚，b為待鑒別膠囊)Fig.3 Com parison of HPLC-PDA chrom atogram s(a．Bing’s giant salamander，b．capsules)

2.2 羌活魚藥材與膠囊制劑質(zhì)譜比對 由羌活魚和待鑒別膠囊樣品部分離子的基峰質(zhì)荷比 (m/z)比對結(jié)果，可知羌活魚和待鑒別膠囊中相同或相近保留時間組分的離子，其基峰比值在1.000 0～1.000 2之間，誤差小于0.02%，進(jìn)一步證明兩者相對應(yīng)成分的一致性。由羌活魚和待鑒別膠囊對應(yīng)色譜峰的質(zhì)譜棒狀圖比對結(jié)果，亦可對膠囊制劑進(jìn)行識別，如圖4為6.5 min出峰質(zhì)荷比為262.2的質(zhì)譜棒狀圖比對結(jié)果，其圖譜的一致性進(jìn)一步證實(shí)兩者待比較化合物相同。綜合圖3、圖4和表2數(shù)據(jù)，可知羌活魚膠囊制劑內(nèi)容物主要為羌活魚，基本未添加其它成分。

圖4 6.5 m in峰的質(zhì)譜棒狀圖比對Fig.4 Comparison of MS rod-shape of peaks at 6.5 m in

3 結(jié)語

3.1 目前，針對藥材的質(zhì)控識別或真?zhèn)舞b別，僅限于對原藥材化學(xué)成分、形態(tài)學(xué)或個別成分含量進(jìn)行質(zhì)控或鑒別比較，缺乏由藥材粉末制成的膠囊制劑的準(zhǔn)確鑒別方法。本實(shí)驗(yàn)介紹了一種基于HPLC技術(shù)，結(jié)合PDA圖譜比對、相對保留值比對、UV光譜比對、基峰質(zhì)荷比 (m/z)比對或MS棒狀圖比對的快速鑒別中藥材膠囊制劑的方法。通過原藥材與待鑒別膠囊的指紋圖譜比對結(jié)果可知，在HPLC-PDA、UV、HPLC-MS等圖譜輪廓相似度高的基礎(chǔ)上，對相關(guān)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行量化處理，其主要組分的相對保留時間比值rt2/rt1大都在0.98～1.03之間，誤差小于2%，綜合判別可知膠囊內(nèi)容物主要成分與原藥材基本相同。

表2 羌活魚與待鑒別膠囊相對保留時間與質(zhì)荷比比較Tab.2 Com parison of retention time and m/z of Bing’s giant salamander and its capsule

3.2 由冬蟲夏草及其膠囊樣品相對峰面積比值結(jié)果可知，其相對比值rA2/rA1范圍較大 (0.96～1.35之間)，誤差為35%，說明膠囊內(nèi)除該藥材外還有一定質(zhì)量的添加劑成分影響了峰面積。由羌活魚及其待鑒別膠囊樣品的部分碎片離子的基峰質(zhì)荷比(m/z)比對結(jié)果可知，其相同或相近保留時間組分的離子基峰比值極為接近 (1.000 0～1.000 2之間)，誤差僅為0.02%。

3.3 由于膠囊制劑內(nèi)容物除藥材本身外還添加有其他成分影響峰面積比較，因此建議在HPLC-PDA指紋圖譜、共有峰HPLC-UV及HPLC-MS棒狀圖輪廓比對法基礎(chǔ)上，將藥材與其膠囊樣品的相對峰面積比值結(jié)果僅作為參考，而將相對保留時間比值rt2/rt1(如規(guī)定比值在0.95～1.05之間為鑒別標(biāo)準(zhǔn))和離子基峰比值 (如規(guī)定比值在0.99～1.01之間為鑒別標(biāo)準(zhǔn))作為主要比對依據(jù)，同時比對共有峰的紫外吸收光譜圖，以實(shí)現(xiàn)藥材同其膠囊制劑的快速準(zhǔn)確鑒別。

致謝:感謝廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院張焜教授對本工作給予的幫助和指導(dǎo)。

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