張 蕾， 馮志強(qiáng)，， 陳孝健， 姚美村

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510080)

中藥有效成分口服吸收部位和機(jī)制的探討是提高中藥口服給藥生物利用度、研究開發(fā)其口服給藥制劑的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芩中的總黃酮是其藥理活性的主要藥效成分?，F(xiàn)建立黃芩總黃酮胃腸道吸收機(jī)制的Caco-2細(xì)胞模型，以HPLC法測定黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A的濃度，對黃芩總黃酮吸收機(jī)制進(jìn)行初步研究。

Caco-2細(xì)胞模型 (Caco-2 cellmodel)來源于人類結(jié)腸腺癌組織，以普通的培養(yǎng)條件培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞即可形成與小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和致密的單細(xì)胞層組織，其形態(tài)和功能上與人體的小腸上皮細(xì)胞相似［1］。利用Caco-2細(xì)胞模型，可在體外進(jìn)行藥物的攝?。?］、轉(zhuǎn)運(yùn)［3-4］、代謝［5］等過程研究，是探索藥物吸收機(jī)制和高通量篩選的有效工具，并已被國內(nèi)外廣泛用于研究各種活性物質(zhì)體外吸收的各個(gè)環(huán)節(jié)。本研究運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型，首次對黃芩總黃酮的吸收機(jī)制進(jìn)行研究，為其制劑研究、口服給藥等提供信息。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;CO-150型CO2培養(yǎng)箱，NBS公司;Millicell-ERS跨膜電阻儀，Millipore公司;IX51型倒置顯微鏡，OLYMPUS公司;飛鴿高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;Precisa XS225A萬分之一分析天平;Dionex P680高效液相色譜儀，UVD170 U檢測器。

1.2 試藥 0.25%胰蛋白酶 －0.02%EDTA、DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素，Gibco公司;L-谷氨酰胺，MBCHEM公司;胎牛血清、非必需氨基酸，Hyclone公司;Hanks緩沖溶液 (HBSS，自制);黃芩苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200212)、漢黃芩素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:1514-200202);漢黃芩苷對照品 (西安融升生物科技有限公司，批號:091126，純度＞98%);千層紙素A(自制，純度＞98%);色譜乙腈 (Merk公司)。其余試劑為分析純。

1.3 材料 12孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板、25 cm2卡式細(xì)胞培養(yǎng)瓶，Corning公司。

1.4 細(xì)胞 Caco-2細(xì)胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫 (原代來源于美國典型菌種保藏中心ATCC，American Type Culture Collection)實(shí)驗(yàn)中，所用細(xì)胞代數(shù)為35～45代。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品貯備液 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A對照品適量，用色譜甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1 000、14.1、112、107μg/mL的對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃芩總黃酮噴霧干燥粉末適量，用pH6.5的HBSS溶解并稀釋成400μg/mL，臨用前配制，用于Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)－0.1%甲酸水 (B)梯度洗脫，程序?yàn)?→5 min，32%→35%A，5→15 min，35%→50%A，15→25 min，50%→50%A;體積流量1.0 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量20μL

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 分別進(jìn)樣空白基質(zhì) ［在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)給藥前，用HBSS緩沖液將Caco-2細(xì)胞沖洗3次，最后一次置于37℃培養(yǎng)箱溫孵30 min，然后收集腸腔側(cè) (AP側(cè))到基底側(cè) (BL側(cè))的溫孵液混合、混合對照溶液和供試品溶液以考察分析方法的專屬性。結(jié)果表明，各待測組分與相鄰色譜峰分離度良好，空白基質(zhì)在相應(yīng)保留時(shí)間處無雜質(zhì)干擾。典型色譜圖見圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A對照貯備液適量，用空白HBSS緩沖液配制成黃芩苷濃度為1.12、2.24、5.60、22.4、56.0、112μmol/L，漢黃芩苷濃度為 0.050 8、0.101 6、0.254、1.016、2.54、5.08μmol/L，漢黃芩素濃度為 0.134、0.268、0.67、2.68、6.7、13.4μmol/L，千層紙素A濃度為0.13、0.26、0.65、2.6、6.5、13.0μmol/L的混合系列對照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，黃芩苷為y=28 667C－5 673(r=0.992 8);漢黃芩苷為y=46 964C+1 698(r=0.992 1);漢黃芩素為y=22 375C+468(r=0.997 9);千層紙素A為y=19 649C －469(r=0.998 4)。

2.2.4 準(zhǔn)確度與精密度 用空白HBSS緩沖液以及空白基質(zhì)分別配置低、中、高3個(gè)濃度的QC樣本，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣本濃度，計(jì)算方法的精密度 (RSD)和準(zhǔn)確度 (RE)，結(jié)果見表1。

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC chrom atogram s

表1 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of accuracy and precision

2.3 Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)［6-9］用DMEM完全培養(yǎng)液將復(fù)蘇后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在25 cm2卡式細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃ 培養(yǎng)箱 (通入5%CO2，相對濕度在90%)中培養(yǎng)。隔天換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化，按1∶3的比例傳代。取對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為8×104～2×105個(gè)/cm2，接種0.5 mL到12孔Transwell板AP側(cè)，BL側(cè)則加入1.5 mL培養(yǎng)液。接種后一周內(nèi)隔天換液，1周后每天換液，培養(yǎng)至21 d。檢測堿性磷酸酶活性和各孔跨膜電阻 (均大于500Ω/cm2)，細(xì)胞形成緊密單層后即可用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 表觀滲透系數(shù) (Papp)及表觀滲透率(PDR)的計(jì)算 表觀滲透系數(shù) (apparent drug permeability coefficient，Papp)的計(jì)算公式為:

表觀滲透率 (滲透方向率，PDR)的計(jì)算公式為:

其中，PappB→A為受試藥物從BL到AP側(cè)的表觀滲透系數(shù)，PappA→B為受試藥物從AP到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù)。

2.3.3 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 取符合轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的Transwell板，吸棄培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)熱的HBSS蕩洗3次，于最后一次置培養(yǎng)箱中溫孵30min后，收集空白基質(zhì)，進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。在AP→BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，加0.5 mL供試品溶液到AP側(cè)作為供給池，1.5 mL的pH為7.4的空白HBSSBL側(cè)作為接收池;在BL→AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，則將1.5 mL藥物加到BL側(cè)作為供給池，0.5 mL空白HBSS到AP側(cè)作為接收池，置于培養(yǎng)箱中。分別于15、30、60、90、120、180 min從接收池吸取 100μL轉(zhuǎn)運(yùn)液 (12 000 r/min離心5 min，取上清液)，同時(shí)用空白HBSS補(bǔ)足，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行孔。結(jié)果見圖2和表2。

圖2 時(shí)間對4個(gè)黃酮類成分轉(zhuǎn)運(yùn)量AP→BL和BL→AP的影響 (n=3， ± s)Fig.2 Effect of time on Caco-2 cell transport of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

表2 4種黃酮類成分在Caco-2細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的P app值(n=3， ± s)Tab.2 P app value of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

表2 4種黃酮類成分在Caco-2細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的P app值(n=3， ± s)Tab.2 P app value of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

化合物 P app/(1×10－6 cm·s－1)P app A→B P app B→A PDR黃芩苷 1.65±0.38 1.23±0.24 0.75漢黃芩苷 1.58±0.21 1.22±0.16 0.77漢黃芩素 1.57±0.15 1.27±0.07 0.80千層紙素A 5.74±0.18 5.13±0.19 0.89

3 討論

3.1 在Caco-2細(xì)胞模型中，可以通過測定藥物不同濃度下在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量、滲透系數(shù)Papp值以及表觀滲透率，而確定藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。若藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨濃度和時(shí)間的增加而增大，則提示該藥物以被動(dòng)擴(kuò)散為主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;若表觀滲透率小于1.5，即AP→BL的Papp值與BL→AP的Papp值大致相同，兩者比值約為1，也可確定被動(dòng)擴(kuò)散為藥物的主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;而若藥物的表觀滲透率大于1.5，則提示藥物可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，藥物的表觀滲透系數(shù)Papp值＞10－6cm/s，說明藥物的吸收良好;若Papp值 ＜10－7cm/s，則藥物的吸收較差 (吸收＜1%)。

3.2 本研究中，黃芩提取物總黃酮給藥Caco-2細(xì)胞單層后，4種黃酮類成分從AP側(cè)到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù) Papp值在1 ×10－6～6 ×10－6cm/s，說明藥物吸收良好;轉(zhuǎn)運(yùn)量呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，且PDR值均約為1，提示4種黃酮類成分均以被動(dòng)擴(kuò)散為主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，與小柴胡湯復(fù)方中黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式一致［10］。另外，黃芩苷單體給藥AP→BL的Papp值為0.664±0.103［11］，而本研究黃芩提取物中黃芩苷AP→BL 的 Papp為 (1.65 ±0.38) ×10－6cm/s，黃芩提取物中其它成分可促進(jìn)黃芩苷的吸收;文獻(xiàn)［12］表明千層紙素A單體給藥AP→BL的Papp值與BL→AP的Papp值均為1×10－6cm/s(PDR值均約為0.79)，本研究黃芩提取物中千層紙素A AP→BL的 Papp值與 BL→AP的 Papp值均為5×10－6cm/s(PDR值均約為0.89)，由此可見，黃芩提取物中其它成分的存在亦促進(jìn)了千層紙素A的吸收，但其作用并無方向性。

3.3 中藥黃芩在臨床上用途廣泛，并且在許多方劑中均有配伍使用，這就意味著它與其它配伍組分存在著廣泛的相互作用。利用Caco-2細(xì)胞單層模型來研究單體及整體給藥后主要藥效成分的腸吸收，為其在胃腸道介導(dǎo)的藥物相互作用的系統(tǒng)性深入研究等奠定了基礎(chǔ)。

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