李小會(huì)， 趙明君， 雷根平， 蘇衍進(jìn)

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046;2.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng)712046)

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是糖尿病心、腦、腎三大嚴(yán)重并發(fā)癥之一。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病已成為終末期腎病的主要原因，慢性腎功能衰竭透析病人中糖尿病腎病占43%左右，并已成為糖尿病的主要死亡原因之一［1］，在我國(guó)糖尿病的患病率快速上升，糖尿病腎病在終末期腎病中占15%。根據(jù)糖尿病腎病的病機(jī)特點(diǎn)［2］——消渴日久，腎虧陰陽(yáng)兩傷;同時(shí)“腎絡(luò)瘀阻”貫穿糖尿病腎病病程始終，更是產(chǎn)生并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，抓住“腎虛”與“腎絡(luò)瘀阻”的主要病機(jī)，采用通絡(luò)益腎法以經(jīng)方腎氣丸合抵當(dāng)湯化裁組成通絡(luò)益腎方，前期的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)該方能改善糖尿病腎病患者及大鼠的血糖、血脂、腎功能［3-5］。本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，觀察高糖下大鼠腎小球系膜細(xì)胞 (glomerularmesangial cell)增殖、細(xì)胞外基質(zhì) (extracellularmatrix)調(diào)控系統(tǒng)基質(zhì)金屬蛋白酶-9/金屬蛋白酶組織抑制物-1(Matrix metalloproteinase-9/Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，MMP-9/TIMP-1)和轉(zhuǎn)化 生 長(zhǎng) 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)及該方的干預(yù)效果，從細(xì)胞水平探討其腎保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1，購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。通絡(luò)益腎方(桃仁12 g、生地30 g、山萸肉15 g、山藥15 g、酒大黃10 g、水蛭3 g、黃芪30 g、淫羊藿10 g、葛根12 g、澤瀉12 g、茯苓12 g、牛膝12 g，水煎，每日一劑)。藥物經(jīng)過常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥材2.23 g，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸貝那普利 (洛汀新)，規(guī)格10 mg/片，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn);糖適平規(guī)格為30 mg/片，北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購(gòu)自Sigma公司，二甲基亞砜 (DMSO)、胰蛋白酶購(gòu)自CIBCO公司，MMP-9 ELISA試劑盒、TIMP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RB公司。

1.2 方法

1.2.1 制備含藥血清 健康雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量 (180±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組、通絡(luò)益腎方大、中、小劑量組，每組7只。通絡(luò)益腎方大、中、小劑量組各按13.4 g/(kg·d)、6.7 g/(kg·d)、3.35 g/(kg·d)灌胃給相應(yīng)中藥，西藥對(duì)照組按糖適平18 mg/(kg·d)加洛汀新5 mg/(kg·d)灌胃給藥，正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥2 h后，頸動(dòng)脈取血，離心取血清，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，除菌過濾后，分裝凍存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 參考文獻(xiàn) ［6-7］，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的3～5代大鼠腎小球系膜細(xì)胞，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后接種于孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基同步化24 h后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入藥物血清。實(shí)驗(yàn)共分6組:高糖組只加入30 mmol/L葡萄糖;空白對(duì)照組加入30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清;通絡(luò)益腎方中藥治療組 (設(shè)大、中、小三個(gè)劑量組)加入30mmol/L葡萄糖+通絡(luò)益腎方大、中、小劑量10%的含藥血清;西藥對(duì)照組加入30 mmol/L葡萄糖+洛汀新、糖適平10%的含藥血清。每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后待檢。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法 (MTT法)檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖 上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)液，加入PBS 200 μL沖洗兩次，再加入180μL培養(yǎng)液以及MTT溶液，37℃孵育4 h終止培養(yǎng)，加入 DMSO 150μL，室溫避光震蕩10 min，于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm處的吸光度值 (A570)。

1.2.4 培養(yǎng)上清液中 TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清 TGF-β1、MMP-9及 TIMP-1水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較用方差分析，以P≤0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 通絡(luò)益腎方對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，高糖組腎小球系膜細(xì)胞顯著增殖 (P＜0.01);與高糖組比較，通絡(luò)益腎方高、中、低各劑量組均能顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖 (P＜0.01或P＜0.05)，其中以高劑量組效果最佳，呈劑量依賴性;西藥對(duì)照組對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的抑制作用和通絡(luò)益腎方中劑量組相當(dāng) (P＞0.05)。見表1。

2.2 通絡(luò)益腎方對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞上清液中TGF-β1、MMP-9和 TIMP-1表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，高糖組大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9水平呈著減少 (均P＜0.01);與高糖組比較，通絡(luò)益腎方大、中、小劑量組 TGF-β1和 TIMP-1水平均顯著減少，MMP-9表達(dá)升高 (P＜0.05或P＜0.01)，尤以高劑量組療效最佳，呈劑量依賴性;西藥對(duì)照組上述指標(biāo)表達(dá)水平和通絡(luò)益腎方中劑量組相當(dāng)，兩組比較P＞0.05。見表2。

表1 通絡(luò)益腎方對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

表1 通絡(luò)益腎方對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與高糖組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01;與西藥對(duì)照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與通絡(luò)益腎方大劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 OD值空白對(duì)照組12 0.61±0.33高糖組 12 0.89 ±0.41＊＊西藥對(duì)照組 12 0.72 ±0.49＊＊△通絡(luò)益腎方大劑量組 12 0.66±0.25△△#通絡(luò)益腎方中劑量組 12 0.73±0.38△△★通絡(luò)益腎方小劑量組 12 0.81±0.51△★★

表2 通絡(luò)益腎方對(duì)MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

表2 通絡(luò)益腎方對(duì)MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與西藥對(duì)照組比較，#P＜0.05;與通絡(luò)益腎方大劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 TGF-β1MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1空白對(duì)照組 12 55.91±8.37 38.54±6.80 18.45±2.70 1.57±0.18高糖組 12 88.49±9.32＊＊ 18.75±5.65＊＊ 29.74±3.78＊＊ 0.64±0.04＊＊西藥對(duì)照組 12 74.76±6.93＊＊ 28.26±4.40△＊＊ 21.68±3.74△＊ 1.18±0.07△＊通絡(luò)益腎方大劑量組 12 60.34±7.28△△# 35.59±4.67△△# 18.75±0.91△△# 1.51±0.15△△#通絡(luò)益腎方中劑量組 12 71.89±6.85★△△ 29.77±5.63△△★ 22.71±2.92△★ 1.25±0.11△★通絡(luò)益腎方小劑量組 12 80.76±9.15★★△ 24.48±4.75△★★ 25.47±2.62△#★ 0.87±0.09△#★★

3 討論

糖尿病腎病的主要病理變化為腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多和腎小球結(jié)節(jié)性或球性硬化。其中細(xì)胞外基質(zhì)合成/降解失衡以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的直接原因。細(xì)胞外基質(zhì)堆積是腎小球纖維化的基礎(chǔ)，是糖尿病腎病發(fā)展成終末期腎病的核心問題［8］。既往有關(guān)糖尿病腎病中細(xì)胞外基質(zhì)變化的研究多關(guān)注于其合成增多的過程，而晚近研究顯示細(xì)胞外基質(zhì)降解能力下降在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起著更為重要的作用，并已成為研究的熱點(diǎn)。基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng) (matrix metal loproteinases，MMPs)是調(diào)控腎臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝的重要降解酶系統(tǒng)，能降解除多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分［9］。其中MMP-9主要由腎小球系膜細(xì)胞分泌，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制因子，能與活性MMP-9以1∶1比例結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，阻斷MMP-9與底物結(jié)合，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。因此，MMP-1/TIMP-1在細(xì)胞外基質(zhì)積聚和降解的生理平衡中起關(guān)鍵作用［8］。同時(shí)，在糖尿病腎病腎小球硬化的過程中，多種細(xì)胞因子形成網(wǎng)絡(luò)參與其中，而TGF-β1為這些復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心因子［10］，在糖尿病腎病的發(fā)病中占有重要地位。實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β1可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞過度增殖，作用呈劑量依賴性［11］。其通過促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞過度增殖［12］;增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV型膠原、纖連蛋白，層連蛋白的合成，使其在腎小球沉積［13］;促進(jìn)蛋白酶抑制因子 (纖溶酶原激活抑制因子PAI)、TIMP-1的合成，抑制MMP-9的生成與活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積［14］，因此其被認(rèn)為是引起腎小球硬化的最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。

通絡(luò)益腎方由抵當(dāng)湯合腎氣丸化裁組成，方中生地黃、山萸肉滋陰補(bǔ)腎;水蛭、酒大黃、桃仁活血破血、逐瘀通經(jīng);山藥健脾補(bǔ)肺、益腎固精。此三藥補(bǔ)虛兼以破瘀，共為臣藥。黃芪補(bǔ)氣生陽(yáng)、利水消腫;附子辛性溫補(bǔ)腎陽(yáng)、補(bǔ)火暖土;澤瀉、茯苓利水滲濕泄?jié)?川牛膝補(bǔ)益肝腎、逐瘀通經(jīng)利水，兼具佐使之用。全方合用，消補(bǔ)兼施，活血通絡(luò)，滋陰助陽(yáng)，與糖尿病腎病之腎虧陰陽(yáng)兩虛，血瘀絡(luò)阻病機(jī)針對(duì)性符合，故而取得較好療效。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高糖能明顯促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞上清液中TGF-β1和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9水平減少，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚集;通絡(luò)益腎方低、中、高劑量組均能顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，使TGF-β1和TIMP-1水平減少，MMP-9水平增加，以高劑量組作用最佳，呈劑量依賴性;西藥對(duì)照組對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的抑制作用和通絡(luò)益腎方中劑量組相當(dāng)。提示通絡(luò)益腎方可能通過抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和下調(diào)TGF-β1、TIMP-1，升高M(jìn)MP-9水平以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。

［1］Rai JL．Recommendations for themanagementof special populations:renal disease in diabetes［J］．Am JHyPertens，2003，16(11):46-49.

［2］李小會(huì)，董正華，丁 輝．糖尿病腎病病因病機(jī)的探討［J］．陜西中醫(yī)，2005，26(6):552-553．

［3］董正華，楊新博，應(yīng)小平，等．通絡(luò)益腎湯對(duì)DN模型大鼠腎組織α-SMA表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(2):357-358．

［4］董正華，宋春光，應(yīng)小平，等．通絡(luò)益腎湯對(duì)DN模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CK-18的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(1):88-90．

［5］董正華，通絡(luò)益腎湯治療糖尿病腎病30例［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2007，41(9):46．

［6］彭 爽，曹文富，劉占術(shù)，等．解聚復(fù)腎寧對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)血小板衍生生長(zhǎng)因子-β的影響［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31(1)65-68．

［7］趙雯紅，陳志強(qiáng)，張江華，等．益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對(duì)高糖聯(lián)合AngⅡ培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的影響［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2011，12(8):669-672．

［8］Ahn JD，Morishita R，Kaneda Y，et al．Transcription factor decoy for AP-1 reducesmesangial cell proliferation and extracellularmatrix production in vitro and in vivo［J］．Gene Ther，2004，11(11):916-923

［9］段曉虹，董競(jìng)成，何立群，等．補(bǔ)腎活血方對(duì)腎小球硬化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)狀態(tài)的影響［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(11):1197-1200．

［10］Kanwar Y S，Wada J，Sun L，et al．Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression［J］．Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):4-11.

［11］Ten Dijke P，Goumans M J，Itoh F，et al．Regulation of cell proliferation by Smad proteins［J］．JCell Physiol，2002，191(1):1-16.

［12］Saulo K，Morrissey JJ．The role vasoactive compounds，growth factors and cytokines in the progression of renal disease［J］．Kidney Int，2000，57(Suppl175):1417-1422.

［13］Sehena F P，Gesualdo L．Pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］．J Am Soc Nephrol，2005，16(Suppl 1):530-533.

［14］程 虹．腎臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2003，30(5):477-480.