林靜云 白志毅 李家樂

三角帆蚌（Hypriosis cumingii）隸屬雙殼綱（Bivalvia）、蚌科（Unionidae）、帆蚌屬（Hypriosis），是我國重要的淡水育珠蚌，主要分布于洞庭湖、太湖和鄱陽湖等大中型湖泊及其流域中［1］。自1979年人工繁殖成功，三角帆蚌已成為我國最重要的經(jīng)濟(jì)淡水珍珠蚌［2］。目前我國淡水珍珠年產(chǎn)量達(dá)1 800多噸，占世界淡水珍珠總產(chǎn)量的95％以上，占我國珍珠總產(chǎn)量的98％以上［3］，其中超過90％的淡水珍珠產(chǎn)自于三角帆蚌［4］，但產(chǎn)值僅占世界10％。這種產(chǎn)量與產(chǎn)值強(qiáng)烈反差的現(xiàn)象主要是由我國珍珠質(zhì)量不高所致［5］，從而嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此尋找提高珍珠質(zhì)量的新措施，尤其是運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)手段，是珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。而建立提高珍珠質(zhì)量的新的生物學(xué)措施則必須闡明珍珠的形成機(jī)理，目前對于珍珠形成機(jī)理的研究主要集中在貝殼上，這是因?yàn)樨悮ず驼渲樵谖⒂^結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成上被認(rèn)為是相同的物質(zhì)［6］。

貝殼由大約95％的文石和5％的有機(jī)大分子復(fù)合而成，其中有機(jī)大分子包括基質(zhì)蛋白和其他的一些生物高聚物［7］?；|(zhì)蛋白雖然所占組分很少，但它不僅能夠參與有機(jī)珍珠層框架的構(gòu)建，決定碳酸鈣晶體的多型構(gòu)象，還控制著文石晶體的成核與生長［8，9］?；|(zhì)蛋白在外套膜中的表達(dá)與其在貝殼中的分布相對應(yīng)，具有區(qū)域化的特點(diǎn)。外套膜邊緣分泌的基質(zhì)蛋白參與了棱柱層的形成，為棱柱層基質(zhì)蛋白；外套膜中央分泌的基質(zhì)蛋白主要參與珍珠層的形成，為珍珠層基質(zhì)蛋白。根據(jù)基質(zhì)蛋白在貝殼中的分布和外套膜中表達(dá)的區(qū)域性的特點(diǎn)，可以明確所發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)蛋白的分類和功能。例如，MSI60在外套膜中部特異性地表達(dá)，是貝殼珍珠層基質(zhì)蛋白，參與珍珠層的形成；MSI31特異性地表達(dá)在外套膜的邊緣，是棱柱層基質(zhì)蛋白，參與棱柱層的形成［10］；nacrein基因在外套膜的中部與邊緣均有表達(dá)，屬于兩者共有的基質(zhì)蛋白［11］。

Perlucin基質(zhì)蛋白是從鮑的珍珠層中最先分離得到的，屬于珍珠層基質(zhì)蛋白，具有提高碳酸鈣晶體形成速度，修飾晶體形態(tài)等功能。它不僅是珍珠層的組成部分，也是對貝殼和珍珠的形成具有重要功能的大分子［12，13］。然而在淡水珍珠蚌中對于perlucin基因的研究卻未見報道，為了進(jìn)一步了解Perlucin蛋白對珍珠形成的作用，本試驗(yàn)構(gòu)建Perlucin蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化該表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)條件，并通過Western blot技術(shù)進(jìn)行鑒定。以期為進(jìn)一步研究三角帆蚌Perlucin蛋白的生理功能、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用原理提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21（DE3）、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和硫酸卡納霉素購自上海天根生化科技公司。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB公司。NC膜購自Bio-Rad公司。鼠抗Histag單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。pMD19-T Vector與其他常規(guī)生化試劑均購自大連寶生物工程有限公司。原核表達(dá)載體pET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 perlucin基因ORF的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hcperlucin的構(gòu)建 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已克隆得到的三角帆蚌perlucin基因全長cDNA序列（GenBank登錄號：KC436008），利用Primer Premier 5軟件設(shè)計一對特異性引物。其中上游引物PerF為：5'-CGGGATCCATGGATTTCTCATTGATATTCGT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物PerR為：5'-CGCGAATTCCTAAGACCGTGCCTGACAGAT-3'（下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為終止密碼子）。以三角帆蚌cDNA第一條鏈為模板，用包含酶切位點(diǎn)的特異性引物PerF、PerR擴(kuò)增三角帆蚌perlucin基因ORF的全長。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min，共 30 個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T Vector后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖菌提取質(zhì)粒，用限制性酶BamHⅠ和 EcoRⅠ分別雙酶切處理帶有目的片段的pMD19-T和pET-28a。酶切片段與線性化質(zhì)粒pET-28a連接并轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）。使用菌落PCR篩選陽性克隆，進(jìn)一步通過雙酶切鑒定。同時將陽性克隆測序鑒定，以確定插入序列正確。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及重組蛋白表達(dá) 將經(jīng)過鑒定過的工程菌接種于4mL LB液體培養(yǎng)基（含硫酸卡那霉素50μg/mL）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600介于0.4-0.6，加入終濃度1mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，取20mL菌液離心收集菌體，超聲破碎，離心后取上清，沉淀用8mol/L的尿素溶解，以SDS-PAGE（濃縮膠濃度 50mg/mL，分離膠濃度12mg/mL）分析重組蛋白表達(dá)情況。同時設(shè)置未誘導(dǎo)的工程菌作為陰性對照。

1.2.3 最佳誘導(dǎo)溫度試驗(yàn) 取過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌液BL21按1∶50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600介于0.4-0.6，加入終濃度為1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在30℃、37℃和42℃條件下誘導(dǎo)4h后各取20mL菌液離心收集菌體，超聲破碎，對離心后的沉淀以SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)的最佳溫度條件。

1.2.4 最佳誘導(dǎo)時間試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600介于0.4-0.6時，在“1.2.3”確定的目的蛋白表達(dá)的最佳溫度條件下加入終濃度為1mmol/L IPTG，分別于誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10和12h后各取20mL菌液，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量，確定目的蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時間。

1.2.5 最佳誘導(dǎo)劑濃度試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，在“1.2.3”和“1.2.4”確定的最佳誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間條件下，加入不同濃度的IPTG，使其終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0mmol/L 7個濃度梯度，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量，確定目的蛋白表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.6 Western blot分析鑒定 重組融合蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上。NC膜浸泡于封閉液中于室溫放置1h后，用鼠抗His-tag單抗與之于4℃條件下反應(yīng)過夜，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，各步驟之間用含體積分?jǐn)?shù)0.1％的Tween-20的磷酸緩沖液（TTBS）洗膜4次，每次10min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色液顯色至有清晰的目的條帶出現(xiàn)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 perlucin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增到約483bp的基因片段。將回收純化的目的片段轉(zhuǎn)入pMD19-T Vector后，構(gòu)建pMD-19T-Hcperlucin重組質(zhì)粒，對該質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將酶切產(chǎn)物中的目的片段與表達(dá)載體pET-28a連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pET-28a-Hcperlucin重組表達(dá)質(zhì)粒，菌落PCR擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果483bp大小一致的特異性條帶（圖1-A）。對該重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，也得到一條長約483bp的條帶（圖1-B），與預(yù)期大小一致。對酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行測序，序列比對結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體pET-28a-Hcperlucin已構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒 pET-28a-Hcperlucin菌液PCR鑒定（A）及雙酶切鑒定（B）

2.2 三角帆蚌perlucin重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

2.2.1 重組融合蛋白表達(dá) 收集的工程菌經(jīng)超聲破碎，分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

與未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌相比，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，菌體蛋白沉淀泳道處多出1條明顯條帶，其大小與預(yù)測的重組蛋白分子量相近，約21kD，而上清泳道則無相應(yīng)的條帶（圖2），表明重組融合蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 pET-28a-Hcperlucin重組蛋白的表達(dá)分析

2.2.2 最佳誘導(dǎo)溫度 在其他條件一致的情況下，不同誘導(dǎo)溫度下重組融合蛋白的表達(dá)量的結(jié)果（圖3）表明，37℃條件下蛋白表達(dá)量明顯高于42℃下的表達(dá)量，而30℃條件下的表達(dá)量很低。所以該重組融合蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度是37℃，并且以包涵體形式表達(dá)。

2.2.3 最佳誘導(dǎo)時間 誘導(dǎo)時間是影響重組融合蛋白表達(dá)量的重要因素之一，在其他條件一致的情況下，經(jīng)不同時間（0-12h）誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)時間在6h以內(nèi)，重組融合蛋白的表達(dá)量隨著時間的延長而增高，但是隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組融合蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢（圖4）。這表明長時間誘導(dǎo)不但不能提高重組蛋白表達(dá)量，還使表達(dá)量下降，故該重組融合蛋白的最佳誘導(dǎo)時間是6h。

圖3 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖4 不同時間誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.2.4 最佳誘導(dǎo)濃度 在其他條件一致的情況下，不同濃度的IPTG（0.1-2.0mmol/L）均可明顯誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá)。濃度在0.1-1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的重組融合蛋白表達(dá)量變化不大，但在1.5mmol/L和2.0mmol/L的濃度下，表達(dá)量明顯下降（圖5）。由于高濃度IPTG不利于細(xì)菌生長，因此該重組融合蛋白的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度是0.1mmol/L。

2.3 重組融合蛋白的Western blot鑒定

在優(yōu)化的表達(dá)條件下，對重組融合蛋白進(jìn)行Western blot分析（圖6）顯示，重組融合蛋白可與His-tag單克隆抗體結(jié)合，表現(xiàn)出與重組融合蛋白大小一致的條帶，結(jié)合pET-28a-perlucin 質(zhì)粒的測序結(jié)果可推斷，已成功表達(dá)三角帆蚌Perlucin蛋白。

圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖6 用His-tag單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析

3 討論

由于大腸桿菌具有易于培養(yǎng)、繁殖快、表達(dá)量高、成本低、易純化、遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，因此以大腸桿菌為載體的原核表達(dá)系統(tǒng)目前被廣泛采用，成為高效表達(dá)研究的首選體系，其中BL21是應(yīng)用最廣的宿主菌［14］。pET-28a載體的N、C端帶有Histag，有利于表達(dá)蛋白純化和鑒定，且不影響重組融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，是抗原蛋白表達(dá)常用載體。因此本研究選用pET-28a為原核表達(dá)載體，將三角帆蚌perlucin基因的ORF序列連接到載體上，導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，成功獲得pET-28a-Hcperlucin重組質(zhì)粒，并通過對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化，提高了蛋白的表達(dá)量。同時根據(jù)載體上的6個His標(biāo)記，通過與His-tag單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行Western blot鑒定蛋白，確認(rèn)所得蛋白為目的蛋白。

試驗(yàn)結(jié)果表明，重組融合蛋白在37℃、誘導(dǎo)6h、IPTG濃度為0.1mmol/L的條件下能大量表達(dá)目的蛋白，但主要以包涵體的形式存在。重組大腸桿菌在30℃時為最適表達(dá)溫度，37℃為最適的細(xì)菌生長溫度［15］。然而，在本試驗(yàn)中，重組蛋白在30℃的時候表達(dá)產(chǎn)物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于37℃，而盤鮑中該重組蛋白在37℃同樣能夠得到較好的表達(dá)［16］，這說明重組蛋白最佳誘導(dǎo)溫度可能受到插入目的基因的影響。誘導(dǎo)劑IPTG 會阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，使外源基因大量表達(dá)，但高濃度的 IPTG 誘導(dǎo)會阻礙蛋白的表達(dá)［17］。本試驗(yàn)的誘導(dǎo)結(jié)果同時說明長時間的誘導(dǎo)并不能進(jìn)一步提高蛋白的表達(dá)量。而IPTG的濃度在1.0mmol/L的范圍內(nèi)也不會對重組融合蛋白表達(dá)產(chǎn)生較大影響。IPTG雖然對細(xì)胞沒有毒害作用，但可以通過改變培養(yǎng)基的酸堿度，從而抑制細(xì)菌生長［18］。因此，在表達(dá)量相差不大的情況下，應(yīng)選用濃度較低的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果顯示，重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin可與鼠抗Histag單抗特異性結(jié)合，說明本研究獲得了pET-28a-Hcperlucin表達(dá)產(chǎn)物。這為抗體制備、體外結(jié)晶試驗(yàn)、進(jìn)一步探究Perlucin蛋白的生理功能、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用原理提供了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

將三角帆蚌perlucin基因序列連接到表達(dá)載體pET-28a中，IPTG誘導(dǎo)重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin在大腸桿菌中表達(dá)。重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin的最優(yōu)表達(dá)條件為37℃、誘導(dǎo)6h、IPTG濃度為0.1mmol/L。通過與鼠抗His-tag單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行Western blot鑒定，確認(rèn)所得為目的蛋白。

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