何文俊 劉紅 葉玲玲 李世崇 王啟偉 陳昭烈

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是一種未分化的具有自我更新能力的細(xì)胞，在胚胎發(fā)育和基因功能研究、藥物篩選和新藥開發(fā)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種質(zhì)培育以及組織修復(fù)和細(xì)胞治療等領(lǐng)域顯示出巨大優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景［1-3］。自1996年P(guān)ain等［4］首次在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)禽類胚胎干細(xì)胞（chicken embryonic stem cells，cESCs）獲得成功以來，分離和培養(yǎng)禽類多能干細(xì)胞已成為轉(zhuǎn)基因禽培育、珍稀禽類保種和脊椎動(dòng)物早期發(fā)育研究模型制備的重要前提［5-7］。隨著近年來由禽類胚胎干細(xì)胞衍生細(xì)胞系被越來越多地用作治療性抗體和病毒疫苗的生產(chǎn)系統(tǒng)，禽類胚胎干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和建系再次成為干細(xì)胞研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)［8-10］。

由于禽類具有獨(dú)特的生殖生理特點(diǎn)和胚胎發(fā)育過程，雞的受精卵排出體外時(shí)處于胚胎發(fā)育的X期。X期胚胎中的胚盤細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，且能參與各種組織的形成，從X期胚胎中可能會(huì)培養(yǎng)出多能性細(xì)胞。本研究從X期的雞胚中分離胚盤細(xì)胞，旨在獲得典型的呈集落生長(zhǎng)的雞ESCs克隆并在體外培養(yǎng)體系中保持未分化狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 白來杭雞種蛋購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所。昆明白孕小鼠（孕期14-16d）購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雞血清、100×非必需氨基酸和TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；胰蛋白酶、HEPES購(gòu)自Hyclone公司，明膠、β-巰基乙醇和DAPI購(gòu)自Sigma公司；白血病抑制因子（LIF）和100×核苷購(gòu)自Millipore公司，絲裂霉素C和鏈霉蛋白酶購(gòu)自Roche公司，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，bFGF、hIGF-1、mSCF和hIL-11購(gòu)自Peprotech公司，抗SSEA-1單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司，抗Oct-4多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Forma公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司，超純水制備機(jī)購(gòu)自MILLI-Q公司，倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自Zeiss公司，PCR儀購(gòu)自Biometra公司，電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠，凝膠成像采集系統(tǒng)購(gòu)自United-Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備 處死孕期14-16d的昆明白孕小鼠，無菌條件下取出胚胎后去其頭部和內(nèi)臟，PBS充分洗滌，將其剪碎后用胰酶溶液（0.25％胰酶+0.04％ EDTA）分階段消化，適時(shí)終止消化，吸取上層懸液并離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以5×105cells/mL重懸于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）生長(zhǎng)培養(yǎng)基（DMEM，10％ FBS），接種于100mm組織培養(yǎng)皿中，37℃孵育至細(xì)胞長(zhǎng)滿。細(xì)胞傳至第2代時(shí)，用10μg/mL的絲裂霉素C處理2h，PBS沖洗3次，加入適量胰酶溶液消化，收集細(xì)胞，重懸于MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以104cells/cm2接種于0.1％明膠包被的24孔培養(yǎng)板中。

1.2.2 X期胚盤細(xì)胞的分離 參照文獻(xiàn)［11，12］使用紙環(huán)法分離獲得胚盤細(xì)胞。取新鮮的未孵化的白來杭雞種蛋，新潔爾滅浸洗后再用75％酒精消毒。在超凈工作臺(tái)內(nèi)小心剝?nèi)サ皻?，將卵黃從蛋清中分離出來。辨別卵黃上的胚盤位置，使胚盤朝上放置，剪一小塊正方形的濾紙，在其中央打一個(gè)圓形的孔，并將其輕輕放在卵黃上，使胚盤暴露在孔的中央。在濾紙周邊剪開卵黃膜，然后將濾紙從卵黃上輕柔地提起，將貼附有胚胎的濾紙緩慢垂直浸入PBS中，清除胚胎上的卵黃，分離整個(gè)胚盤，將其收集到離心管中，PBS漂洗，1000r/min離心5min，收集細(xì)胞。

1.2.3 cESCs的培養(yǎng) 參照van de Lavoir等［11］和陳勝峰等［13］的方法并加以改進(jìn)。X期胚盤細(xì)胞用ESC生長(zhǎng)培養(yǎng)基（DMEM、10％ FBS、2％雞血清、1％非必需氨基酸、1％核苷、10mmol/L HEPES、0.16mmol/L β-巰基乙醇、100U/mL 青霉素 /鏈霉素、10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11、1000U/mL LIF）重懸，機(jī)械吹打后以1個(gè)胚盤/cm2的細(xì)胞密度接種到MEF滋養(yǎng)層上。每天換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，用0.025％鏈霉蛋白酶消化傳代，PBS漂洗后接種于新鮮的MEF滋養(yǎng)層上。

1.2.4 cESCs的鑒定

1.2.4.1 堿性磷酸酶（AKP）染色 細(xì)胞用PBS漂洗，冷的4％多聚甲醛固定15min，再用底物緩沖液（100mmol/L Tris-HCl pH9.5，50mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，0.1％ Tween-20）平衡，然后加入染色液（75mg/mL NBT溶于70％ DMF，50mg/mL BCIP溶于100％ DMF，染色前分別取45μL NBT溶液和35μL BCIP溶液溶于底物緩沖液），37℃孵育30min。PBS漂洗后倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4.2 免疫熒光染色 PBS漂洗細(xì)胞，然后加入冷的4％多聚甲醛固定15min。PBS漂洗，加入0.3％Triton X-100作用30min。PBS漂洗，加入0.5％ BSA封閉20min。吸掉封閉液，加一抗SSEA-1（1∶50）或Oct-4（1∶50），4℃孵育過夜。PBS漂洗，加二抗FITC標(biāo)記的羊抗小鼠或兔IgG（1∶50），室溫避光孵育1h。PBS漂洗，0.1μg/mL DAPI復(fù)染細(xì)胞核15min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.3 RT-PCR TRIzol裂解細(xì)胞，進(jìn)行總RNA的提取，具體操作參照TRIzol試劑說明書。RT-PCR反應(yīng)總體系50μL，RNA樣品各1μg，引物序列見表1，條件為50℃反應(yīng)30min。接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，20個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸5min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀保存圖像。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 cESCs的培養(yǎng)

雞Ⅹ期胚盤細(xì)胞在MEF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下可見散在分布的圓形或橢圓形細(xì)胞集落，其上附有卵黃顆粒和脂滴（圖1-A）；培養(yǎng)4d后，細(xì)胞集落明顯增大、與MEF的邊界清晰，形成類似早期胚胎組織的擬胚體，集落內(nèi)的cESCs彼此緊密接觸，界限不清（圖1-B）。cESCs在體外培養(yǎng)的第2-4d增殖旺盛，此后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，原代cESCs的體積較小，細(xì)胞核相對(duì)較大，胞質(zhì)相對(duì)很少。

圖1 在MEF滋養(yǎng)層上生長(zhǎng)的原代cESCs（100×）

2.2 cESCs的鑒定

2.2.1 AKP染色 AKP的存在是細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的一個(gè)重要標(biāo)志。采用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒檢測(cè)集細(xì)部落中cESCs的AKP表達(dá)，染色陽(yáng)性的細(xì)胞呈棕紅色，陰性細(xì)胞不著色，證實(shí)集落中大部分的細(xì)胞保持未分化狀態(tài)（圖2）。

圖2 原代cESC的AKP染色鑒定（100×）

2.2.2 免疫熒光染色 SSEA-1（stage-specific embryonic antigen 1）是早期胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原，轉(zhuǎn)錄因子Oct-4可能是脊椎動(dòng)物不同發(fā)育階段多潛能細(xì)胞所特有的特異調(diào)控分子，是公認(rèn)的胚胎干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志。ESCs特異性標(biāo)志的免疫熒光染色顯示原代cESCs表達(dá)SSEA-1（圖3-B）和轉(zhuǎn)錄因子Oct-4（圖3-D）。激光共聚焦顯微鏡（圖4）顯示，SSEA-1表達(dá)于細(xì)胞膜上，Oct-4表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 原代cESC的免疫熒光染色鑒定（100×）

2.2.3 cENS-1的RT-PCR分析 雞胚胎正常干細(xì)胞基因（chicken embroynic normal stem cell gene，cENS）是cESCs和雞早期胚胎特異表達(dá)的基因家族，包括cENS-1、cENS-2和 cENS-3。cENS-1的 RT-PCR分析（圖5）顯示，原代cESCs和X期胚盤細(xì)胞表達(dá)cENS-1，雞胚成纖維細(xì)胞不表達(dá)cENS-1。

圖4 原代cESCs的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察（1000×）

圖5 原代cESCs的RT-PCR鑒定

3 討論

cESCs大多數(shù)來源于X期未孵化的明區(qū)胚盤細(xì)胞［11］。胚盤提取時(shí)，在保證胚盤完整的情況下應(yīng)盡快將其取出并放入到PBS中以除去卵黃和卵黃膜，得到用于培養(yǎng)的胚盤細(xì)胞。剛?cè)〕龅呐弑P細(xì)胞間粘連作用并不是很強(qiáng)，在原代分離時(shí)不易用胰蛋白酶消化，一般借助于機(jī)械吹打就可以將細(xì)胞分離開來。而經(jīng)一段時(shí)間的體外培養(yǎng)后細(xì)胞間的粘連作用增強(qiáng)，此時(shí)需要借助胰蛋白酶的作用同時(shí)輔以機(jī)械剝離將cESCs分散［14，15］。在cESC的傳代過程中，一般將細(xì)胞集落分散為20-40個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)并以一定密度接種，有助于發(fā)揮細(xì)胞間的協(xié)同作用，防止細(xì)胞分化，促進(jìn)克隆生長(zhǎng)。本研究在cESC的傳代過程中用鏈霉蛋白酶替代胰酶消化傳代cESC，不需輔以機(jī)械剝離或過度機(jī)械吹打就能有效地分散cESC。

cESCs體外培養(yǎng)的關(guān)鍵是保證其維持未分化狀態(tài)，常用的方法是合理設(shè)計(jì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、采用滋養(yǎng)層細(xì)胞以及添加細(xì)胞因子。cESCs對(duì)能量與營(yíng)養(yǎng)的要求很高，故選用高糖DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、核苷酸等物質(zhì)。滋養(yǎng)層在cESCs的培養(yǎng)過程中起著重要的作用，既可促進(jìn)cESCs貼壁生長(zhǎng)，又可分泌各種因子抑制 cESCs分化［16，17］。用于制作滋養(yǎng)層的細(xì)胞主要有STO細(xì)胞、MEF、同源動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞等。小鼠ESCs成功建立以來，MEF被廣泛用于多種動(dòng)物的ESCs培養(yǎng)，很多培養(yǎng)基和細(xì)胞因子的添加都是針對(duì)MEF設(shè)計(jì)的。此外，cESCs的生長(zhǎng)還需依賴特定的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如bFGF、SCF和LIF等。bFGF和SCF可刺激細(xì)胞增殖并防止細(xì)胞分化［18，19］。LIF因子是目前廣泛采用的一種細(xì)胞分化抑制因子，對(duì)小鼠ESCs的生長(zhǎng)至關(guān)重要，在維持cESCs的多能性特征中也是必需的［17］。另一個(gè)細(xì)胞因子LIF的家庭成員IL-11，也有利于雞胚盤細(xì)胞維持cESCs樣特征［19］。

基于以上考慮，本研究采用傳至2代并經(jīng)絲裂霉素C處理的MEF為滋養(yǎng)層，在高糖DMEM培養(yǎng)基中添加10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11和1000U/mL LIF等細(xì)胞因子組成的cESCs培養(yǎng)體系mL。與陳勝峰等［13］和陳致勝等［20］的同類研究相比較，這一培養(yǎng)體系除采用MEF替代雞胚成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層外，還有包括hIGF-1和hIL-11在內(nèi)的種類更為豐富的細(xì)胞因子。研究結(jié)果表明這一培養(yǎng)體系能有效地支持cESCs的體外生長(zhǎng)并保持未分化狀態(tài)。

ESCs的特點(diǎn)是細(xì)胞小而圓，排列緊密，核質(zhì)比高，并具有較強(qiáng)的內(nèi)源性AKP活性。本研究所分離培養(yǎng)的cESCs也呈集落樣生長(zhǎng)，集落中的細(xì)胞小而圓，排列緊密，同樣具有較高的內(nèi)源性AKP活性。SSEA-1表面抗原和轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的存在是cESCs保持未分化狀態(tài)的另一個(gè)重要指標(biāo)［21］。本研究所分離培養(yǎng)的cESCs表達(dá)SSEA-1和Oct-4，表明其具有cESCs表型。cENS是cESCs有別于其他動(dòng)物細(xì)胞的特異性基因家族［22］。cENS-1的RT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)，本研究所培養(yǎng)的cESCs還表達(dá)雞cENS-1。以上結(jié)果表明，來源于X期雞胚的胚盤細(xì)胞的cESCs具有與其他脊椎動(dòng)物共享某些ESCs特征，物種間胚胎祖細(xì)胞的這些抗原決定簇是高度保守的。

4 結(jié)論

從雞X期胚胎中分離胚盤細(xì)胞，在MEF為滋養(yǎng)層和高糖DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11和1000U/mL LIF等細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系中獲得典型的呈集落生長(zhǎng)的cESCs克隆。cESCs克隆具有較高的內(nèi)源性AKP活性并表達(dá)多能性標(biāo)志SSEA-1和Oct-4。采用培養(yǎng)體系能有效的自雞X期胚胎分離cESCs并維持其在體外生長(zhǎng)并保持未分化狀態(tài)。

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